Hormona de crecimiento bioactiva en humanos

La historia de la investigación sobre hormona de crecimiento (GH) cubre más de 80 años, a menudo con resultados controversiales. Uno de los hallazgos controversiales es la detección de un factor de crecimiento que escapa al inmunoensayo, pero que tiene actividad GH en un bioensayo de tibia de rata. En el transcurso de las investigaciones han surgido tres conceptos claves: (1) una subpoblación de células somatotropas de la hipófisis responde a señales de los núcleos hipotalámicos y secreta formas bioactivas similares a HC (bGH-L) que son pobremente reconocidas por antisueros GH dirigidos contra la forma nativa (22kDa). (2) Señales periféricas y/o propioceptivas (aferentes neurales) producidas por músculos de las extremidades  regulan el contenido y liberación de bGH-L. (3) La hipófisis humana contiene un péptido, no relacionado estructuralmente con la GH, que es activo en bioensayos de tibia.

   ¿Cómo se define bGH-L? La definición está restringida a las respuestas de crecimiento in vivo de las pruebas  del organismo tras inyección. Estas incluyen: a) ensanchamiento de la placa de crecimiento de la epífisis tibial en ratas hipofisectomizadas (test tibial) o b) respuestas anabólicas en ratas hipofisectomizadas (cambio muscular y peso corporal).

   La historia del aislamiento de HG de tejidos de hipófisis de varias especies mamíferas comienza en los años 40. En 1956, CH Li propuso que un mejor  nombre para la hormona podría ser “hormona metabólica”. Actualmente, no hay una respuesta directa y simple a la pregunta de cómo se debe medir la actividad biológica de la hormona. En 1978, los estudios de Ellis y colaborados demostraron que el tratamiento de extractos de hipófisis de rata con antisuero GH falló en neutralizar a este factor biológicamente activo. Más tarde, sus experimentos demostraron que los resultados de los ensayos biológicos e inmunológicos no se correlacionan. A partir de estos experimentos surgió el concepto de una dicotomía entre la hormona bioactiva (bGH-L) y la hormona inmuno-reactiva (iGH), una dicotomía que fue confirmada por otros investigadores poco tiempo después. Aunque la(s) razón(es) sigue siendo desconocida, la modificación estructural de la proteína nativa, 191 aminoácidos, 22 kDa, durante su liberación por la hipófisis fue propuesta como un mecanismo para explicar la dicotomía. Durante este período, los tres bioensayos de crecimiento más usados fueron a) el ensayo de ganancia de peso en ratas hembras, b) el ensayo de ganancia de peso en ratas hipofisectomizadas inmaduras y c) el test tibial. El test tibial es especialmente útil para medir concentraciones de bGH-L en plasma humano. La sensibilidad del ensayo es  relativamente alta (3-5 µg), pequeños volúmenes de muestra pueden ser examinados y el ensayo puede realizarse en un período relativamente corto (4 días).

   ¿Por qué es la dicotomía un problema tan complejo? En 2009, Baumann identificó la respuesta: la heterogeneidad surge a nivel del gen GH, el “splicing” de mARN, el procesamiento post-traslacional y el metabolismo de GH. Baumann también definió otros factores de confusión tales como: a) variantes de hGH que no están disponibles en forma pura, b) la posibilidad  que la actividad biológica de las variantes pueda variar entre las especies (por ejemplo, rata y humano y c) el rol e importancia de las proteínas ligadoras de GH en el metabolismo de la GH, cada una de las cuales contribuye a la complejidad del problema. Baumann concluye: “la heterogeneidad de GH es una importante razón para la notoria disparidad entre los resultados de los ensayos… y  el significado biológico de esta heterogeneidad se mantiene grandemente desconocido”.

   Las concentraciones de bGH-L en hipófisis humanas obtenidas en autopsias fueron reportadas por Parlow en 1974. Los datos obtenidos en 542 individuos, expresados en términos de GH bovina estándar, claramente relejan que las concentraciones de bGH-L aumentan con el avance de la edad. Por otra parte, los resultados del laboratorio del Dr Grindeland indican las siguientes concentraciones de bGH-L de hipófisis (ensayo tibial): rata 200-300 µg (iGH); 24-36 µg (bGH-L); humano 4,4 mg (iGH); 0,53 mg (bGH-L). Las pruebas médicas sugieren un rango de 4-8 mg iGH/glándula en la hipófisis postmorten. Casi 10% del peso seco de la hipófisis es GH. Esta concentración es aproximadamente 800 veces mayor que cualquier otra hormona de la hipófisis.

   Los resultados de 10 estudios recientes comparan las concentraciones de bGH-L e iGH en plasma humano después de ejercicio y contracciones musculares voluntarias. Los estudios revelan que las mediciones de la  actividad bGH-L están consistentemente en el rango de varios miles de µg/L mientras las mediciones de iGH en estas muestras son solo de unos pocos µg/L. Esta disparidad es una función del punto final del ensayo. En este contexto es importante señalar que las preparaciones de GH, purificadas de hipófisis de diferentes especies mostraron curva dosis respuesta paralelas en el ensayo tibial. Las curvas de crecimiento tibial similares mostradas por estas preparaciones permitieron expresar la potencia biológica en términos de una hormona estándar de 22 kDa. De 292 individuos (190 hembras, 102 varones), la mayoría (n= 226) eran jóvenes (19-27 años). Las concentraciones de bGH-L en 938 muestras de plasma fueron varios miles de µg/L de plasma (2000-4000), pero este rango fue extremadamente variable. 917 de las 938 muestras de plasma contenían cantidades detectables de bGH-L por el ensayo tibial. Sin embargo, 21 muestras tenían concentraciones indetectables. Estas 21 muestras se obtuvieron de personas con edad promedio de 81 años, aunque las muestras de plasma de otras personas de esa edad en el mismo grupo contenían concentraciones de bGH-L en el rango de 7000-9000 µg/L.

   La principal variable en 8 de los 10 estudios fue el ejercicio de diferentes tipos: ejercicio de resistencia para grupo grande de músculos, ejercicio de resistencia para grupo pequeño de músculos para flexión tobillo plantar o ejercicio aeróbico. En estos 8 estudios, los objetivos primarios fueron: a) encontrar si las concentraciones plasmáticas de bGH-L cambian después de un ejercicio agudo y b) cómo se relacionan con las mediciones de iGH. En 4 de los 10 estudios el ejercicio agudo incrementó las concentraciones plasmáticas de bGH-L, respuesta aparentemente relacionada con el entrenamiento previo al ejercicio; en 2 estudios disminuyó la concentración plasmática de bGH-L mientras  en los 4 restantes no se reportaron cambios con respecto a los controles apropiados. Colectivamente, estos resultados apoyan la hipótesis que el entrenamiento al ejercicio prepara a la hipófisis para que incremente la liberación de bGH-L en respuesta a los futuros estresores del ejercicio. La variabilidad en la respuesta al ejercicio que se observa en la bGH-L aparentemente se debe a diferentes variables externas que modifican el contenido de la hipófisis, la plasticidad celular. Estas variables como edad, sexo, composición corporal, dieta, ambiente, modalidad de ejercicio y estado de entrenamiento pueden contribuir a las variaciones en la concentración plasmática de bGH-L.

   En los años 70, los estudios en plasma y extracto de hipófisis de rata revelaron la presencia de un potente factor de crecimiento hipofisario que no fue detectado por los métodos basados en anticuerpos, pero que era activo en el bioensayo tibial. El factor de crecimiento fue llamado GH bioactiva para distinguirla de la forma fácilmente detectada por inmunoensayo (la nativa GH 22 kDa); el antisuero GH falló en neutralizar la respuesta al crecimiento y, en este sentido, fue similar a la conducta de la actividad similar a insulina no suprimible (NSILA), una actividad atribuida a los péptidos IGF-1 e IGF-2. Los resultados indicaron una potencia bGH-L equivalente a 3000 veces la de la iGH. En esos años se propuso un enlace metabólico, debido a  que los pre-tratamiento de las ratas (hipoglucemia inducida por insulina, ayuno o exposición al frío) redujeron el contenido hipofisario de bGH-L por 65%, incrementaron las concentraciones plasmáticas de bGH-L, pero no tuvieron ningún efecto sobre la concentración plasmática de la iGH hipofisaria. 

   Años más tarde, Grindeland, Hymer y sus colaboradores reportaron mayores diferencias entre la secreción de iGH y bGH-L en tejido de hipófisis de rata después de la exposición a un ambiente de baja gravedad. Estos hallazgos estimularon experimentos que examinaron la hipótesis que perturbaciones propioceptivas en el sistema neuromuscular de la rata también podrían modular la liberación hipofisaria de bGH-L. Estos estudios permitieron el descubrimiento de un nuevo eje aferente muscular-hipófisis que regula la secreción de bGH-L. Las ratas entrenadas a correr sobre una correa sin fin por 15 min a 27 m/min tenían concentraciones plasmáticas de bGH-L 300% mayor y concentraciones hipofisarias de bGH-L 50% menores que los controles, pero las concentraciones de iGH en estas muestras no fueron diferentes a las de los controles. Más aún, la estimulación de ciertos nervios de las extremidades, afectaron diferencialmente la secreción de bGH-L. Específicamente, la estimulación de los nervios peroneal  o tibial (los cuales inervan músculos de contracción rápida) incrementó la bGH-L plasmática más de 250% mientras redujo 60% el contenido hipofisario de bGH-L. Por el contrario, la estimulación del nervio sural cutáneo no afectó y la estimulación del nervio soleo o la activación de músculos de contracción lenta, inhibieron la secreción de bGH-L. Los patrones de estimulación en estos estudios identificaron fibras aferentes de bajo umbral y diámetro grande como un mecanismo para provocar la respuesta bGH-L. En resumen, la activación de aferentes musculares rápidas o lentas tienen efectos opuestos sobre la liberación de bGH-L. La ruta muscular precisa que controla la bGH-L hipofisaria debe involucrar proyecciones neuronales bien establecidas de la médula espinal lumbar al hipotálamo a través del tracto espino-hipotalámico que provoque la liberación de GHRH en el sistema porta.

   Una segunda ruta posible es sugerida por estudios que combinan técnicas neuroanatómicas, de desnervación e inmunoquímica  que demuestran (a) que las fibras que liberan sustancia P inervan directamente la hipófisis anterior a través del ganglio nodoso (cervical inferior) y (b) que la sustancia P, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina y las fibras nerviosas positiva a galanina están presentes en la hipófisis anterior de humanos, monos, perros y ratas. Estos hallazgos aumentan la posibilidad que los péptidos hipotalámicos así como también conexiones neurales peptidérgicas directas puedan teóricamente regular la secreción de bGH-L. Esto ha dado lugar a la hipótesis que…”el estrés metabólico agudo y/o activación de grupos de músculos específicos juegan un rol importante en el control del metabolismo de carbohidratos por movilización de bGH-L durante amenazas a la homeostasis”.

   Los estudios de separación de células de hipófisis de rata se basan en las diferencias en las características físicas de las células como tamaño y/o densidad. Estos estudios revelaron que dos poblaciones de células están presentes en la suspensión inicial obtenida por centrifugación; una (somatotropas ligeras, también llamadas células tipo I) con densidad < 1.071 g/cm³, mientras la otra (somatotropas pesadas, también llamadas células tipo II) tiene densidades entre 1.071-1.085 g/cm³. Cada una de estas dos fracciones representa aproximadamente 40% del total de células somatotropas contenidas en la suspensión inicial. Las células densas son granuladas con gránulos de secreción de 300 nm, y escasas regiones de retículo endoplásmico y aparato de Golgi. Las células menos densas son escasamente granuladas, pero tienen abundantes regiones  de retículo endoplásmico y aparato de Golgi. Aproximadamente 48% del total de células somatotropas son de tipo denso. Las células somatotropas tipo I producen péptido tibial que es liberado en la forma bGH-L 5 kDa en el espacio pericapilar.

   Los avances en la tecnología de imágenes  in vivo revelaron que las células endocrinas y no endocrinas de la hipófisis anterior están organizadas en redes estructurales y funcionales. Los resultados indican que los cambios manejados por geometría se correlacionan con la función de las células GH. Los principales hallazgos indican que (a) la red GH es sexualmente dimórfica; (b) la red GH muestra plasticidad funcional en su relación con la fisiología del animal; (c) la plasticidad de la red GH continúa en la adultez aunque puede ser más “flexible” en animales viejos. Las células GH forman una red dinámica, funcionalmente reversible. Todas las células GH, en bandas que se cruzan, están conectadas unas con otras por uniones adherentes. Estos hallazgos solidifican el concepto que el acoplamiento localizado de células, en regiones específicas de la hipófisis, ofrece un mecanismo dominante para el control interno de la función celular en grupos de células GH en la glándula individual. Las técnicas de imágenes tridimensionales demuestran que 30% de las células somatotropas están completamente aisladas de espacios perivasculares mientras 70% están próximas a endotelio vascular. La distribución citoplasmática de los gránulos de secreción es uniforme en el primer caso o asimétrica en el segundo caso, pues los gránulos se acumulan en áreas citoplasmáticas próximas a los vasos a los vasos.

   La biología vascular de la hipófisis es compleja. Dos de los tres principales tipos de capilares (fenestrados y sinusoidales) están presentes en la hipófisis. Mientras los capilares fenestrados tienen poros con un diafragma que permite el paso de solutos con una permeabilidad variable, el endotelio de los capilares sinusoidales tiene un espacio entre las células que permite el paso de grandes solutos como las proteínas plasmáticas. El mantenimiento de los vasos hipofisarios es regulado por hormonas hipotalámicas a través de la señal VEGF. Por otra parte, la sustancia P puede ser parte de una red reguladora para la secreción de hormonas por la hipófisis anterior de varias especies, incluyendo rata y humano. Los tractos de fibras que liberan sustancia P se encuentran en las regiones caudal y central de la glándula.

   La fragmentación de la hormona nativa 22kDa en dos péptidos, hGH 1-43  y hGH 44-191 afecta su fisiología, el fragmento más corto tiene una potencial actividad insulínica mientras el fragmento más largo tiene actividades anti-insulina, lo cual implica que la hormona nativa actúa como una prohormona. El clivaje enzimático entre los residuos treonina-142 y tirosina 143 de la molécula hGH produce una variante de dos cadenas con un fragmento amino-terminal unido por puente disulfuro a un fragmento carboxilo terminal más pequeño que mantiene las dos cadenas juntas. El clivaje proteolítico puede ocurrir durante la secreción por acción de una proteasa unida a la membrana. Aproximadamente 50% de la GH 22 kDa está unida a una proteína ligadora de alta afinidad (GHBP). Esta proteína es la versión soluble del dominio extracelular del receptor de GH (GHR) en humanos. Dos trabajos recientes documentan la importancia del GHR en salud y enfermedad. Uno de los trabajos puntualiza que el GHR virtualmente está presente en todas las células del cuerpo. Los autores enfatizan dos clases de actividad para la GH: 1) acción a través de mediadores/citoquinas de señalización; 2) modulación a través de su acción clásica sobre la regulación de la producción de IGF-1. Ahora bien, ¿tiene la GHBP actividad bGH-L? Los investigadores han abordado esta importante pregunta en una serie de estudios con preparaciones de a) GHBP sola, o b) GHBP en combinación con GH humana recombinante (rhGH) inyectadas diariamente en ratas hipofisectomizadas y evaluadas 8 días después por cambios en ganancia de peso, crecimiento óseo, hGH e IGF-I en plasma.  Los principales hallazgos fueron que a) la GHBP por sí misma no tiene efecto sobre la ganancia de peso, pero aumenta considerablemente el efecto promotor de crecimiento de la rhGH especialmente en hígado y riñón; y b) la GHBP prolonga la presencia de rhGH en el plasma. Este importante trabajo podría apoyar la idea que el monómero de GH, unido a GHBP en el plasma, califica como otra isoforma bGH-L.

   Las  somatotropas son células secretoras que contienen vesículas secretoras y almacenan y transportan proteínas a la membrana celular por exocitosis. Las preparaciones  de gránulos citoplasmáticos de hipófisis son activas en el ensayo tibial. La presencia de péptido tibial en plasma e hipófisis humana aumenta el número de preguntas sobre  su relación con las  formas nativas de bGH-L, los sitios de procesamiento intracelular y la importancia fisiológica. En un gránulo, la bGH-L unida a iones Zn, existe en forma de agregados en alta concentración (4 nm) con dos iones Zn asociados cooperativamente por dímeros GH. Cada gránulo contiene 5000-10000 moléculas. Algunos gránulos contienen citocromo C, citocromo oxidasa y ATP. Varios estudios demuestran que las interacciones Zn-ATP modulan la liberación de GH de los gránulos GH. Los reportes más recientes demuestran que la GH es almacenada como un amiloide funcional en los gránulos. Los amiloides son definidos por sus hojas cruzadas altamente organizadas en regiones en agregados de proteínas o péptidos. En muchas proteínas el estado amiloide es termodinámicamente estable en alta concentración y no energéticamente favorable en concentraciones bajas de proteína/péptido. La configuración amiloide no solo asegura la liberación eficiente de la forma GH 22 kDa del depósito amiloide, sino también protege a la GH de la degradación enzimática, alta temperatura y rango amplio de pH. ¿Cómo pueden interactuar el péptido tibial y la molécula GH (en su configuración amiloide) en el gránulo de secreción? El péptido tibial puede jugar un rol conector con moléculas GH y Zn en su configuración amiloide. Por otra parte, los exosomas y las vesículas pequeñas son partículas que contienen composiciones moleculares únicas de proteína, lípidos y ácido nucleico, y ofrecen un mecanismo de comunicación intercelular. En este contexto, se especula que el péptido tibial podría ser liberado por las células somatotropas de la hipófisis humana en la forma de un exosoma/vesícula extracelular.

   En conclusión, el modelo sobre los puntos esenciales que subyacen al elemento regulador fisiológico para la producción y liberación de bGH-L por la hipófisis señala la siguiente secuencia de eventos: en respuesta a la señal de a) el hipotálamo y/o b) aferentes neurales de los flexores de las extremidades, algunas células somatotropas (tipo II) son inducidas a agruparse en nodos de la red de células GH. El agrupamiento induce a las células somatotropas tipo II a producir, almacenar y liberar bGH-L. La bGH-L pasa al espacio perivascular para su posterior procesamiento. El péptido tibial puede tener un rol  en 1) una función de conexión al interactuar con GH y Zn en los gránulos de secreción o 2) formar parte de la bGH-L 5 kDa. El Zn también podría aumentar la fusión de moléculas para desarrollar una forma  “super potente” de bGH-L. Estos procesos son controlados en parte por factores fisiológicos y/o ambientales como ejercicio, edad, % de grasa corporal, estrés y gravedad.

Fuente: Hymer WC et al (2020). Bioactive growth hormone in humans: controversies, complexities and concepts. Growth Hormone & IGF Research  50: 9-22.