Activación de JAK2 por hormona de crecimiento

Un buen número de receptores citoquina clase I utilizan la Janus quinasa 2 (JAK2) para su señalización intracelular. Los primeros de esos receptores en ser reportados fueron los de hormona de crecimiento (GH) y eritropoyetina (EPO), posteriormente se reportó que los receptores de prolactina (PRL), interleuquina 3, 5 y 6, factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF), interferón γ (IFNγ), trombopoyetina (TPO) y leptina también reclutan JAK2. El espectro de procesos fisiológicos  regulados por la JAK2, por tanto, es bastante amplio, variando desde el crecimiento postnatal, la reproducción y la lactancia hasta la regulación del metabolismo y la composición corporal, la formación de hueso, la activación de la stem cell neural, la eritropoyesis, la mielopoyesis, la trombopoyesis y la respuesta inflamatoria.  Estos receptores transmembrana usan primariamente la JAK2 para activar los reguladores STAT de la transcripción de genes, pero también  disparan otras rutas de señalización como proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) y  Akt/fosfoinositosido 3-quinasa (PI3K). El esquema del proceso de activación de la JAK2 señala que la citoquina posee múltiples sitios de unión  para su receptor y esa unión facilita  la dimerización o multimerización  del receptor citoquina clase I. Esto resulta en la íntima aposición dentro de la célula  de los dominios quinasa  de  dos JAK 2 asociadas a receptor de membrana proximal  y por consiguiente en su transactivación. La activación de la JAK2  es seguida por la fosforilación de tirosinas en el dominio citoplasmático del receptor lo cual genera  sitios para proteínas que contienen dominios SH2 como STAT3 o STAT5 que son fosforiladas y activadas. La fosforilación del receptor  es acompañada por la fosforilación directa de otras proteínas por la JAK2. Este esquema simple proporciona una explicación para los cambios genómicos y en el citoesqueleto inducidos por citoquinas.

Los receptores citoquina clase I tienen un dominio extracelular (ECD) que contiene al menos un dominio de homología de receptor citoquina (CRH) que a su vez posee dos dominios similares a fibronectina III (FNIII), cada uno con un dominio similar a inmunoglobulina β con siete hebras en dos capas. El dominio proximal de membrana contiene un segmento que crea un nicho aromático necesario para la expresión y estabilidad del receptor. En el caso del receptor de GH, la hormona tiene dos sitios de unión asimétricamente colocados, un sitio 1 de alta afinidad  y un sitio 2 de baja afinidad, los cuales son suplementados por la unión receptor-receptor en el dominio FNIII más bajo (sitio 3). La interacción del sitio 3  es esencial para la transmisión de la señal hormonal.  Una segunda característica es el segmento intracelular Box1 rico en prolina, el cual junto con la secuencia  Box2 distal de residuos aromáticos y ácidos sirve para unir a la JAK2 cerca de la membrana celular interna.  Aunque todos los receptores citoquina clase I tienen la estructura característica de dos dominios FNIII usada para capturar al ligando, hay variaciones entre grupos similares de receptores. Los tipos más simples solo tienen dos dominios FNIII y son homodiméricos cuando se unen a su ligando, mientras otros requieren la interacción de dos subunidades del receptor donde una subunidad forma parte de diferentes complejos citoquina-receptor. En general, estos receptores son activados por asociación de receptores dependiente de ligando. Los dominios transmembrana (TMD) y la secuencia yuxtamembrana  (JM) son los responsables de la formación constitutiva del receptor dimérico.

El modelo de asociación  de receptor inducida por ligando indica que el ECD del receptor de GH puede ser dimerizado por la hormona. Esta dimerización induce la proximidad de la JAK2 asociada y por consiguiente  su transactivación  y el inicio de la señal intracelular. Sin embargo, estudios recientes demuestran que la dimerización de EDC solamente es insuficiente para disparar la activación del receptor por lo que es necesario la alineación o el cambio conformacional del receptor.  La realineación de subunidades del receptor en un dímero pre-existente parece ser el mejor candidato para la generación de señal por el receptor de GH. La unión bivalente de la GH reorienta y rota subunidades del receptor  resultando en una transición  a partir de una forma con  TMD paralelos (estado 1) a una  de TMD entrecruzados en el punto de entrada en el citoplasma (estado 2).  Surge aquí la pregunta clave: ¿cómo la separación de los TMD más bajos  resulta en la activación  de la JAK2 asociada  con el Box1 del receptor? De particular relevancia es la existencia de un dominio pseudoquinasa (PK) adyacente al dominio quinasa, el cual es conocido por ser inhibitorio. De las 518 proteínas quinasa conocidas, 48 contiene dominios PK, pero solo cinco de ellas  (las cuatro JAK y la quinasa serina/treonina GCN2) contienen un dominio quinasa adicional. Por lo tanto, cualquier modelo para la activación  de JAK debe remover el dominio PK del dominio quinasa. El proceso de activación es un evento trans con un dímero receptor/JAK2 más que un proceso de cis-activación. Si el dominio inhibidor PK de una JAK2  bloquea al dominio quinasa  de la otra JAK2 podría remover la inhibición trans  y colocar los dos dominios quinasa en proximidad lo cual podría inducir la activación trans. De acuerdo con el modelo trans, en el estado inactivo, dos moléculas JAK2, cada una unida  a un dominio intracelular del receptor de GH, interactúan de tal manera que el dominio quinasa de una JAK2  es inhibido por el dominio PK de la otra JAK2. La unión de la GH al receptor homodimérico  causa en el dominio intracelular la separación de BOX1 y provoca la separación de la interacción trans PK-quinasa, lo cual resulta en una trans-interacción quinasa-quinasa  y por lo tanto en la activación de JAK2.  Esto resulta en la fosforilación y activación de STAT y otras rutas de señalización relacionadas con el receptor de GH. El modelo trans  del proceso de activación de JAK2 contrasta con las propuestas previas de autoinhibición  con desplazamiento  del módulo inhibitorio PK.

La inhibición de JAK2 es un importante blanco clínico, particularmente para desordenes mieloproliferativos. Estos desordenes comúnmente  resultan de la activación constitutiva  de la señal JAK2 a través de mutaciones de la quinasa, frecuentemente vía mutación JAK2 V617F (especialmente en policitemia vera). Se ha hecho un considerable esfuerzo para desarrollar inhibidores de JAK2 terapéuticamente efectivos, pero hasta la fecha los resultados son limitados. Solamente el ruxolitinib (inhibidor selectivo de JAK1 y JAK2) ha recibido la aprobación  de la Administración  de Alimentos y Drogas (FDA) para el tratamiento  de la mielofibrosis, mientras otros compuestos han sido  discontinuados debido a su toxicidad. El ruxolitinib mejora los síntomas constitucionales  y la esplenomegalia pero no reduce sustancialmente la carga de alelos mutantes en los pacientes y sus beneficios frecuentemente tienen el costo de anemia y trombocitopenia.  

Varios miembros  de la familia de receptores citoquina clase I (especialmente PRLR y EPOR) existen como dímeros inactivos constitutivos,  lo que implica que su activación debe resultar a partir de cambios estructurales  en el receptor transmitidos  a través de los TMD. Dada la naturaleza de la transición de la hélice del dímero  de una forma paralela  a una forma entrecruzada que resulta en la aposición  N-terminal y la rotación de la hélice,  cualquier hélice que pueda encajar en la estructura será capaz de disparar la señal. Esto ha sido comprobado reemplazando la hélice TMD del receptor de GH por la hélice TMD del receptor LDL. Es de hacer notar que todos los receptores clase I  examinados tienen residuos ácidos proximales a la membrana externa, lo cual hace pensar en la posibilidad de un mecanismo de activación similar al descrito con el receptor de GH, una hipótesis que aún no ha sido confirmada.

En conclusión, el receptor de GH y citoquinas estructuralmente relacionadas  interviene en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Estos receptores citoquina clase I hacen eso  acoplando su dominio transmembrana a tirosina quinasas citoplasmáticas. Estudios recientes han revelado que muchos de estos receptores existen como dímeros constitutivos  más que  dimerizados  como consecuencia de la unión de ligando, lo cual ha dado lugar a un nuevo paradigma para describir el proceso de activación. La activación de receptores citoquina clase I por la unión de ligando requiere la activación de la señal a ser transmitida a la JAK intracelular asociada por rearreglos estructurales de  ECD y TMD. Por lo tanto, las moléculas que se unen a la secuencia ECD y/o TMD son potenciales modificadores  de la señal,  inhibiendo la activación o activando al receptor en ausencia de ligando.  Sobre la base de datos bioquímicos  y simulaciones dinámicas moleculares  se propone un modelo para la activación  de la JAK2 por el receptor de GH homodimérico. Según este modelo, la unión del ligando (GH) bivalente reorienta y rota subunidades del receptor, lo cual resulta en una transición  de una forma con TMD paralelos a otra forma con TMD entrecruzados en el punto  de entrada al citoplasma. Este movimiento desliza el dominio PK de una JAK del dominio quinasa de la otra JAK en el complejo receptor dimérico-JAK, permitiendo la interacción de los dos dominios quinasa  y su transactivación. Esto resulta en la fosforilación  y activación  de STAT y otras rutas de señalización  relacionadas con el receptor  de GH para la regulación  del crecimiento postnatal, el metabolismo y la activación de stem cell.

Fuente: Waters MJ y Brooks AJ (2015). JAK2 activation by growth hormone and other cytokines. Biochemical Journal 466: 1-11.

Péptidos natriuréticos cardíacos y obesidad

Desde su descubrimiento en 1981, los péptidos natriuréticos cardiacos (cNP) péptido natriurético atrial  (también conocido como factor natriurético atrial, ANP) y péptido natriurético cerebral  (BNP) han sido caracterizados en términos de sus acciones renales y cardiovasculares. La secreción de cNP por el corazón  es incrementada por estímulos humorales y mecánicos. Por otra parte, los niveles plasmáticos de los cNP son fuertes predictores de eventos cardiovasculares  y mortalidad  tanto en poblaciones sin enfermedad cardiaca aparente  como en pacientes con patología cardiaca establecida. Sin embargo, el significado clínico  de los niveles plasmáticos  de cNP difiere en sujetos obesos y no obesos. En pacientes sin enfermedad cardiaca las mayores concentraciones  de cNP se observan  en sujetos delgados sensibles a la insulina. En pacientes con insuficiencia cardiaca sistólica o hipertensión arterial los niveles de cNP generalmente son altos, mientras en  pacientes obesos con diabetes tipo 2 disminuyen los niveles de cNP. Recientes líneas de evidencia sugieren importantes efectos metabólicos del sistema cNP, el cual activa la lipólisis, aumenta la oxidación de lípidos y la respiración mitocondrial. Clínicamente, estas propiedades producen la “marronización”  del tejido adiposo blanco e incrementan la capacidad  oxidativa muscular.

Los cNP actúan como un enlace básico funcional entre la homeostasis del sistema cardiovascular, la inflamación y ciertas funciones metabólicas.  El principal estimulo mecánico  para la secreción de cNP es el incremento en la presión de las cámaras cardiacas que provoca estiramiento  de las fibras miocárdicas. Este fenómeno es conocido como acoplamiento estiramiento-secreción.  Los estímulos neurohumorales incluyen a la endotelina-1, la angiotensina II, los agonistas adrenérgicos y varias citoquinas. Los incrementos en el estrés de la pared diastólico final y sistólico final del ventrículo izquierdo  se correlacionan con incrementos plasmáticos de cNP en la insuficiencia cardiaca.  Sin embargo, estudios  con pacientes que han recibido trasplante cardiaco reportan que los niveles plasmáticos de cNP se mantienen altos aun después de que se normalizan las presiones intracardiacas. La medición  de cNP es útil  como herramienta de diagnostico y pronostico.  Los altos niveles plasmáticos de cNP (por ejemplo, BNP>63pg/ml) pueden predecir con mucha precisión  los pacientes con riesgo de hospitalización  debido a insuficiencia cardiaca sistólica o muerte cardiovascular. Los pacientes obesos pueden tener niveles plasmáticos bajos de cNP  debido a mecanismos como el incremento en la actividad de la endopeptidasa neutra neprilisina  que resulta en aumento de la degradación  de los cNP circulantes y en aumento de la expresión  del receptor C de péptidos natriuréticos (NPRC) en el tejido adiposo. En este contexto, se ha propuesto que la supresión del procesamiento de la prohormona proBNP_1-108 debido a O-glucosilación  en el sitio de ruptura  donde actúa la convertasa de furina o  corina, previene la  formación de los fragmentos BNP_77-108 (funcionalmente activo)  y N terminal de proBNP, NT-proBNP_1-76 (inactivo), un evento  muy frecuente en estados diabéticos  y de resistencia a la insulina.  En pacientes con insuficiencia cardiaca, los niveles circulantes de proBNP_1-108 son menores que los niveles normales.

Una persona  obesa puede tener el  perfil “obeso metabólicamente sano” o el perfil “metabólico no sano”. El ultimo es definido  por un incremento en la circunferencia de la muñeca (>94 cm en hombres y >80 cm en mujeres) o índice de masa corporal >30 kg/m² acompañado  por dos o más  de los siguientes valores: hipertrigliceridemia (1,7 mmol/l), HDLcolesterol bajo (<1,03 mmol en hombres y <1,29 en mujeres), hiperglucemia (>11,1 mmol/l o un diagnóstico de diabetes),  hipertensión arterial (>130/85 mmHg) o medicación por presión arterial alta.  La obesidad per se  crea un mayor riesgo  para el desarrollo de insuficiencia cardiaca sistólica, especialmente si la obesidad es severa (IMC>40 kg/m²) o de larga duración.  Por el contrario, el riesgo de infarto de miocardio agudo en los sujetos obesos metabólicamente no sanos es significativamente mayor en comparación con los obesos metabólicamente sanos.  Un trabajo reciente reporta que los elevados niveles plasmáticos  de NT-proBNP constituyen un mayor riesgo  de desarrollar insuficiencia cardiaca tanto en obesos como en no obesos. Sin embargo, a diferencia de los no obesos  que muestran una relación directa entre los niveles  de NT-proBNP e insuficiencia cardiaca sistólica, los sujetos obesos muestran  una relación en forma de U; es decir, los sujetos con niveles plasmáticos más bajos tienen mayor riesgo que los sujetos con niveles plasmáticos más altos.  En pacientes con obesidad severa (IMC>40kg/m²) la cirugía bariátrica reduce el IMC  y mejora el control de la diabetes  pero no se sabe  si reduce el riesgo  de eventos cardiovasculares.

La isquemia del miocardio y el estiramiento  de los cardiomiocitos  disparan la liberación de cNP. Estudios recientes demuestran que en los pacientes con enfermedad coronaria estable tanto el BNP como NT-proBNT son fuertes predictores  clínicos de eventos cardiovasculares a largo plazo, especialmente muerte cardiovascular, pero el NT-proBNP  se desempeña mejor que el BNP en la clasificación de riesgo de los eventos cardiovasculares adversos. En humanos, se ha demostrado experimentalmente que  el ANP plasmático  y la presión arterial alta se correlacionan negativamente, los niveles más altos  de ANP se asocian con menor riesgo de presión arterial alta. Otro estudio demostró una deficiencia relativa de cNP en los diferentes estadios  de presión arterial alta  en humanos con bajos niveles plasmáticos  de BNP_76-108  y NT-proBNP_1-76 en los primeros estadios de hipertensión conjuntamente con una reducción de NT-ANP_1-98  en el estadio 1. 

Estudios recientes sugieren una relación inversa entre  niveles circulantes de cNP y  peso corporal, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2.  Varias explicaciones han sido propuestas al respecto. En primer lugar, la degradación aumentada de cNP es una posible causa. Los cNP son aclarados y degradados por la endopeptidasa neutra neprilisina y el receptor C de péptidos natriuréticos (NPRC). El NPRC y el receptor A de péptidos natriuréticos (NPRA) han sido identificados  en abundancia en el tejido adiposo humano, lo que implica que el tejido adiposo tiene una función reguladora sobre el sistema NP. El NPRC aumenta en el tejido adiposo de pacientes obesos hipertensos  en comparación con individuos no obesos y normotensos. La insulina induce la expresión de NPRC en adipocitos  y monocitos humanos y puede relacionar condiciones asociadas con hiperinsulinemia (obesidad, resistencia a la insulina) con un déficit relativo de NP. Adicionalmente, la expresión de los niveles neprilisina   aumenta en la obesidad. Estos datos  sugieren que la obesidad y la resistencia a la insulina  son condiciones en las cuales los cNP son degradados  aceleradamente. En segundo lugar, datos experimentales recientes sugieren que la expresión  miocárdica de BNP disminuye marcadamente en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, una observación que requiere confirmación clínica.

El déficit  de cNP en pacientes con componentes del síndrome metabólico puede ser de relevancia clínica. En primer lugar, puede relacionar la obesidad con la hipertensión arterial. Los individuos obesos  tienen mayor prevalencia de hipertensión arterial que los sujetos delgados. Aunque la hipertensión arterial relacionada con  obesidad ha sido estudiada intensamente, no todos los mecanismos son bien entendidos. Un déficit de cNP  puede contribuir a la hipertensión relacionada con obesidad a través de la reducción de su actividad vasodilatadora y excretora de sodio, así como también  la disminución de  la supresión  del sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS). En sujetos delgados, la aplicación de una carga de sodio induce la secreción miocárdica de cNP y estimula la natriuresis, una respuesta que es bloqueada en los pacientes con obesidad. En conjunto, estos datos apoyan la idea que la obesidad promueve la hipertensión al menos parcialmente  a través de la reducción de las respuestas vascular  y renal de los cNP así como a través de la alteración de la inhibición del RAAS mediada por cNP.  En segundo lugar, los cNP también tienen efectos beneficiosos en la remodelación cardiaca  en la hipertensión esencial, reduciendo la hipertrofia  del ventrículo izquierdo. El déficit de cNP está asociado con hipertrofia cardiaca en pacientes hipertensos. En este  sentido, los pacientes hipertensos con síndrome metabólico presentan bajos niveles  de ANP y NT-proBNP e incremento  de la masa del ventrículo izquierdo en comparación con los pacientes hipertensos sin síndrome metabólico y resistencia a la insulina.

El déficit de cNP en pacientes con síndrome metabólico puede ser parte  de un círculo vicioso  que mantiene la enfermedad. Los cNP tienen distintos efectos metabólicos. Por ejemplo, ejercen efectos lipolíticos mediados por una ruta que es activada por una proteína quinasa G (GK-I)  dependiente de GMPc. La GK-I activa la hidrólisis de triglicéridos mediada por perilipina A y lipasa sensible a hormonas. Este efecto no interactúa con los efectos lipolíticos  de las catecolaminas y es independiente de la regulación  de insulina. Los cNP también controlan la secreción de la adipoquina adiponectina. En humanos, el ANP incrementa agudamente los niveles sistémicos de adiponectina. Este hallazgo  está en línea con  los estudios que demuestran asociaciones positivas  entre cNP  y concentraciones de adiponectina en pacientes con insuficiencia cardiaca. Esta observación  también puede explicar la “paradoja adiponectina” en los pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva.  El ANP también produce desacoplamiento  de la respiración celular y marronización  del tejido adiposo blanco, un efecto que es mediado por la p38 MAPK, la cual incrementa la transcripción de la proteína desacopladora 1 (UCP1).  En condiciones de exposición al frio, aumentan las concentraciones sistémicas de NP y disminuye la expresión de NPRC en el tejido adiposo.

Los cNP también ejercen acciones metabólicas en hígado y músculo esquelético. La administración i.v. de ANP incrementa agudamente  la oxidación de lípidos y el gasto de energía postprandial  en individuos sanos. Los niveles circulantes de β-hidroxibutirato aumentan, lo que indica aumento de la oxidación hepática de lípidos. Además de los efectos agudos sobre la oxidación de lípidos, los cNP inducen la biogénesis mitocondrial, la respiración celular y la oxidación de lípidos  en músculo esquelético de humanos y roedores.  El metabolismo oxidativo aumentado está asociado con protección contra la obesidad inducida por dieta y la resistencia a la insulina. El mecanismo que relaciona  la señal NP con la biogénesis mitocondrial  y la oxidación de lípidos  en el músculo esquelético  incluye la activación del coactivador del receptor γ activado por  el proliferador de peroxisoma PGC-1α (PGC-1α) y el receptor δ activado por el proliferador de peroxisomas, los cuales son importantes factores de la biogénesis mitocondrial en músculo esquelético. La expresión de NPRA se correlaciona positivamente  con la expresión de PGC-1α en músculo esquelético de individuos  sometidos a un programa de entrenamiento físico. La actividad física conjuntamente con una dieta baja en calorías  incrementan crónicamente los niveles de cNP.

El contenido de lípidos en hígado y músculo esquelético ha sido asociado con resistencia a la insulina. En estos tejidos, la resistencia a la insulina se desarrolla  cuando se acumulan especies bioactivas de lípidos  como el diacilglicerol intracelular. En obesidad y síndrome metabólico, la acumulación de lípidos se  debe primariamente  a la excesiva ingesta calórica que excede la capacidad de hepatocitos  y miocitos  para metabolizar o exportar  ácidos grasos. Bajas concentraciones de cNP se correlacionan con mayor probabilidad de resistencia a la insulina  en individuos delgados y obesos. Hasta el presente no hay evidencia que los cNP interactúen directamente con la cascada de señalización de la insulina. En este contexto, se especula que los cNP podrían mejorar la resistencia a la insulina inducida por lípidos a través del incremento de la oxidación de lípidos en hígado y músculo esquelético.

En conclusión, los niveles plasmáticos de cNP  son fuertes predictores de   eventos cardiovasculares y mortalidad en poblaciones sin aparente enfermedad cardiaca  así como en pacientes con patología cardiaca. Los estudios en humanos reportan altas concentraciones  de cNP  en sujetos delgados sensibles a la insulina y generalmente en pacientes con insuficiencia cardiaca sistólica o hipertensión arterial, mientras los individuos obesos y con diabetes tipo 2 expresan niveles reducidos de cNP.  Estas observaciones sugieren que el sistema cNP juega un rol en la fisiopatología  de la enfermedad vascular metabólica.

Fuente: Ramos HR et al (2015). Cardiac natriuretic peptides and obesity: perspectives from an endocrinologist and a cardiologist. Endocrine Connections 4: R25-R36.

Irisina, mionectina y resistencia a la insulina

Las mioquinas son péptidos producidos y secretados por el músculo esquelético con acciones autocrinas, paracrinas y endocrinas. Varias mioquinas han sido identificadas recientemente, incluyendo interleuquinas (IL-6, IL-7, IL-8, IL-15), irisina, miostatina, mionectina, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-1), factor inhibitorio de leucemia (LIF) y proteína similar a folistatina-1 (FSTL-1). La mayoría de estos péptidos son liberados en respuesta a la contracción muscular durante el ejercicio físico  pero también en respuesta a cambios nutricionales. Aunque el músculo responde directamente  a la insulina incrementando la translocación de GLUT4 y la síntesis de glucógeno, las mioquinas influyen  en el metabolismo de la glucosa y el balance energético con acciones en tejido adiposo, hígado, páncreas e intestino. En este contexto, la irisina y la mionectina son importantes mioquinas, secretadas en respuesta al ejercicio físico y diversos nutrientes, que promueven la captación  y oxidación de glucosa y ácidos grasos en hígado y tejido adiposo y, en el caso de la irisina, la termogénesis.

La actividad física regular tiene un rol protector contra varias condiciones patológicas asociadas con el sedentarismo como resistencia a la insulina, obesidad, ateroesclerosis, diabetes tipo 2, desordenes neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. La inactividad física favorece la acumulación de tejido adiposo visceral y la inflamación de bajo grado, la cual está asociada con esas patologías. El ejercicio físico  tiene efectos anti-inflamatorios directos porque disminuye la acumulación de tejido adiposo. Sin embargo, estos eventos solos no explican los efectos beneficiosos del ejercicio. Algunas mioquinas son liberadas durante el ejercicio físico y actúan como mediadoras de algunos de sus beneficiosos efectos. En particular, la irisina y la mionectina actúan sobre el tejido adiposo y el control del metabolismo de glucosa y lípidos y pueden prevenir el desarrollo de resistencia a la insulina.

El tejido adiposo marrón (BAT)  oxida lípidos y produce calor debido a su alto número de mitocondrias y la expresión de la proteína desacopladora 1 (UCP-1). El BAT es activado en condiciones de  temperatura baja y es muy sensible a la insulina, incrementando dramáticamente su irrigación y la captación de glucosa. Estudios recientes demostraron que la actividad del BAT se correlaciona con el incremento del gasto de energía y la pérdida de peso y masa grasa. Los individuos obesos tienen disminuida la actividad del BAT.  Existe un tipo de adipocito, beige o “brite” (brown + white) que tiene características intermedias entre marrón y blanco. Los adipocitos beige  tienen expresión de UCP-1 y la capacidad  de incrementar la termogénesis  cuando son estimulados por el frio  o por activadores β-adrenérgicos. El proceso de estimulación de los adipocitos beige  se conoce como “marronización” y consiste en el desarrollo  de adipocitos beige en los depósitos de tejido adiposo blanco, especialmente subcutáneos, probablemente a partir  de la misma célula precursora  de adipocitos blancos.

La irisina ha sido caracterizada como un producto de la ruptura  de la proteína transmembrana conocida como proteína que contiene dominio fibronectina tipo III-5 (FNDC5). En ratones, la FNDC5 es expresada preferencialmente en músculos oxidativos. En el año 2012, Broström y cols demostraron que el ejercicio físico es capaz de incrementar en el músculo esquelético  la expresión de varios genes involucrados en el gasto de energía  y particularmente en el metabolismo de la glucosa y los lípidos.  Uno de esos genes es FNDC5, localizado en el locus 1p35.1, el cual es expresado como consecuencia de la activación  del coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisoma 1-α (PGC-1α). La proteína FNDC5 (32KD) es clivada y liberada en la circulación en la forma de irisina, una proteína de 22 kD. Los niveles circulantes de irisina aumentan en animales y humanos sometidos a ejercicio, retornando a los niveles normales después del período de ejercicio. La irisina actúa en el tejido adiposo blanco subcutáneo y visceral para inducir su marronización, y por consiguiente incrementa la termogénesis y el gasto de energía. Las concentraciones de irisina en plasma difieren en varios estudios, variando entre 0.04 ng/ml y 2,158 ng/ml, posiblemente debido a diferencias en los kits de inmunoensayos enzimáticos utilizados. La intensidad del ejercicio  se correlaciona positivamente  con el incremento de los niveles circulantes de irisina, independientemente del consumo de energía. Es importante destacar  que todos los estudios  se han hecho con programas de ejercicio aeróbico, estimulando preferencialmente fibras musculares oxidativas. Por otra parte, el ejercicio crónico no se correlaciona  con niveles circulantes elevados de irisina, lo que sugiere la presencia de un mecanismo adaptativo que hace a los individuos físicamente activos  menos dependiente de irisina para el metabolismo de lípidos o más sensibles a la acción de la irisina. Los mecanismos moleculares  de expresión y secreción de irisina y de sus acciones  en el tejido adiposo son sólo parcialmente conocidos. Además de la marronización del tejido adiposo, la irisina también actúa sobre el mismo músculo esquelético induciendo la fosforilación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y la captación de glucosa y ácidos grasos. La regulación y las acciones fisiológicas  de la irisina no son completamente conocidas.

La mionectina, también conocida como isoforma 15 de la proteína relacionada con CIq/TNF (CTRP15), es codificada por un gen localizado en el locus 2q37.3. Esta mioquina  fue descubierta por Seldin y col en el año 2012 y su expresión es estimulada por dos factores principales: ejercicio y  nutrientes. Sin embargo, no está claro si la elevación  de los niveles de mionectina se debe al ejercicio en sí o a la ingesta de glucosa o lípidos después del ejercicio. Los niveles circulantes de mionectina en ayunas son bajos pero se incrementan dos horas después de la ingesta de glucosa o lípidos. La activación por ejercicio y nutrientes de mediadores desconocidos en los miocitos, los cuales pueden incluir la ruta Akt/PI3K, incrementa la secreción de mionectina. Aparentemente, las funciones de la mionectina están relacionadas con el metabolismo de los lípidos y consisten en disminuir los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres a través de la estimulación  de su captación en hígado y tejido adiposo. Estos efectos parecen ser mediados por un incremento de proteínas secuestradoras y transportadoras, como CD36, proteína transportadora de ácidos grasos 1 (EATP-1) y proteína ligadora de ácidos grasos 4 (FABP-4). La mionectina no tiene efectos sobre la lipólisis en los  adipocitos y la homeostasis de la glucosa. Sobre la base de estas observaciones  se ha propuesto que la mionectina podría ser una mioquina sensora de nutrientes que informa a otros tejidos  acerca del estatus  de nutrientes y promueve su captación y almacenamiento. La mionectina también actúa en el hígado  para inhibir la autofagia a través de la activación de la ruta PI3K/Akt/mTOR, lo cual sugiere que simultáneamente regula  y es regulada por el estado nutricional. Sin embargo, las rutas que conducen  a la expresión de mionectina en el músculo  en el período postprandial son desconocidas. Los mecanismos moleculares  de expresión, secreción y acción de la mionectina aún no han sido identificados.

Uno de los mecanismos  que causa resistencia a la insulina es la acumulación  de productos secundarios del metabolismo de lípidos como diacilglicerol, ceramidas y acetil coenzima A. La acumulación de estos productos en los miocitos activa quinasas serina/treonina como c-jun N-quinasa terminal (JNK), IκB quinasa (IKK) y proteína quinasa C (PKC) que conducen a la fosforilación de serina  y a la inactivación del receptor de insulina y sus sustratos. La resistencia a la insulina también se correlaciona con la oxidación alterada de lípidos en las mitocondrias causada por alteraciones de la biogénesis mitocondrial y también por niveles disminuidos de PGC-1α y PGC-1β. Entonces, la disminución en el número de mitocondrias y las alteraciones en los mecanismos de oxidación de lípidos contribuyen a la acumulación de metabolitos secundarios de los lípidos y, por consiguiente, a la inactivación  de la señal insulina. Por otra parte, el incremento de especies reactivas de oxigeno (ROS), debido a lipotoxicidad  y alteraciones de la función mitocondrial, también causa resistencia a la insulina. El desbalance entre compuestos oxidantes y antioxidantes provoca la activación  de rutas de estrés  como JNK, IKK y p38-proteína quinasa activada por mitogenos (p38-MAPK). Las ROS también inhiben la función mitocondrial, lo cual produce acumulación intracelular de ácidos grasos, creándose un círculo vicioso de lipotoxicidad y resistencia a la insulina.  Como resultado de la activación de las rutas de estrés se activan mecanismos  de inflamación celular. JNK y PKC activan a la IKK y la translocación de NF-κB al núcleo y, por consiguiente, la expresión de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral α (TNFα) y la interleuquina 6 (IL-6). La activación de NF-κB también  favorece la expresión  de factores quimioatrayentes  como la proteína quimioatrayente  de monocitos 1 (MCP-1) y el factor inhibitorio  de migración (MIF), los cuales reclutan macrófagos e incrementan su permanencia en los tejidos, especialmente en hígado y tejido adiposo. Los macrófagos constituyen una importante fuente de citoquinas proinflamatorias.  Los lípidos extracelulares, igual que los lípidos intracelulares, también son capaces  de activar rutas  inflamatorias. Los ácidos  grasos libres extracelulares  pueden ser reconocidos  por el receptor similar a toll 4 (TLR-4). Las citoquinas proinflamatorias disparan señales  que crean una retroalimentación inflamatoria. Entonces, la obesidad está asociada con una inflamación de grado bajo, la cual deriva de la excesiva deposición de lípidos  e inhibe la señal insulina en músculo, hígado y tejido adiposo.

La secreción de irisina y mionectina puede ser afectada por el desarrollo  de resistencia a la insulina en el músculo. Varios estudios han demostrado la asociación entre niveles disminuidos de irisina  y resistencia a la insulina o diabetes. Algunos de esos estudios reportan bajos niveles circulantes de irisina en pacientes con diabetes tipo 2 y otros encontraron una correlación negativa con los niveles de glucosa en ayunas y HbA1c. Sin embargo, la regulación de la irisina en la obesidad (sin dismetabolismo de la glucosa) puede ser bastante diferente. Un trabajo reciente reporta niveles circulantes de irisina elevados en mujeres extremadamente obesas. Los niveles de irisina se correlacionaron  con el índice de masa corporal y la masa grasa y los autores describen al tejido adiposo como la principal fuente de la irisina  circulante en esas pacientes.  Los autores del trabajo proponen la hipótesis que la obesidad puede estar relacionada con el desarrollo de resistencia a la irisina, similar a lo que se observa con la insulina y la leptina. Por otra parte, la elevación de los niveles circulantes  de irisina en la obesidad puede ser un mecanismo compensatorio, para inducir el metabolismo de lípidos. La irisina también ha sido examinada como predictor de consecuencias adversas relacionadas con el síndrome metabólico. En individuos obesos con otros factores de riesgo cardiovascular, los altos niveles circulantes de irisina se correlacionan con niveles bajos de HDL colesterol. La irisina también se correlaciona positivamente con los niveles de VLDL, triglicéridos y colesterol total. Dado que todas estas variables representan factores de riesgo cardiovascular, se puede pensar que los elevados niveles circulantes de irisina podrían predecir consecuencias adversas del síndrome metabólico.  Sin embargo, un estudio con pacientes diabéticos demostró que aquellos con  enfermedad macrovascular presentaron niveles bajos niveles circulantes de irisina.  En este estudio, los bajos niveles circulantes de irisina fueron un predictor independiente  de enfermedad macrovacular  en pacientes con diabetes tipo 2.  Estas observaciones apoyan la idea de la regulación hacia debajo de la irisina por la resistencia a la insulina en el músculo, correlacionándose negativamente con el dismetabolismo de la glucosa.

Los niveles circulantes de mionectina disminuyen en ratas alimentadas con una dieta rica en grasas. Este resultado sugiere que la disminución de los niveles circulantes de mionectina podría contribuir a disminuir la captación de ácidos grasos libres en el tejido adiposo y por lo tanto a la elevación de sus niveles circulantes  y a la acumulación ectópica  en otros tejidos. Sin embargo, varios estudios han demostrado incrementos en los niveles circulantes de mionectina en ratas Zucker obesas. Dado  que las ratas Zucker  tienen un defecto genético  en el receptor de leptina y consistentemente presentan hiperleptinemia, tales efectos pueden ser causados  por estimulación crónica de los miocitos por la leptina. En efecto, un estudio reciente demuestra que la leptina actúa sobre el miocito  para inducir la expresión del gen  de la mionectina. Los datos disponibles sugieren que la expresión de mionectina  en el músculo puede ser regulada por la leptina, pero su secreción puede ser disparada por el estado nutricional, como lo demuestra  el incremento en la secreción  después de ejercicio físico. Los estudios sobre los efectos de la resistencia a la insulina en los niveles de mionectina son escasos. Un estudio reciente con cultivos de miotúbulos de ratón  con resistencia a la insulina inducida por palmitato reporta niveles bajos de expresión de mionectina y FNDC5. Los autores del estudio observaron una disminución de la activación de Akt y sugieren que la expresión del gen de  mionectina en el músculo puede ser aumentada por  PI3K y disminuida por p38MAPK. El palmitato disminuye la expresión de PI3K e incrementa la de p38, provocando la disminución de la expresión de mionectina.

En conclusión, la irisina induce la marronización de adipocitos e incrementa la oxidación de lípidos y la termogénesis. Los estudios iniciales sobre la mionectina  revelan  un rol en la captación y oxidación  de ácidos grasos  en hígado y tejido adiposo. Sin embargo, los mecanismos de su regulación por el  ejercicio no están completamente establecidos. El músculo esquelético es uno de los principales blancos de la insulina y uno de los primeros tejidos que desarrolla resistencia a la insulina en condiciones de obesidad y dismetabolismo de lípidos.  Dada su función endocrina  de secreción de factores  que controlan el metabolismo de la glucosa y los lípidos en respuesta al ejercicio  y las alteraciones del estado nutricional, es de esperar que el desarrollo de resistencia a la insulina pueda producir  algunos cambios en las secreciones del músculo esquelético. Estos cambios pueden tener impacto sobre los órganos y tejidos  involucrados en la homeostasis de la glucosa y los lípidos, como el tejido adiposo. Sin embargo, no está claro si la alteración en la secreción de las mioquinas  ocurre como resultado  de la resistencia a la insulina  como un evento paralelo.

Fuente: Gamas L et al (2015). Irisin and myonectin regulation in the insulin resistant muscle: implications to adipose tissue: muscle crosstalk. Journal of Diabetes Research: Article ID359159.

Oxitocina y ERβ en el cerebro

El nonapéptido oxitocina (OT) es producido primariamente en las neuronas de los núcleos supraóptico (NSO) y paraventricular (NPV) del hipotálamo, liberado a la circulación sistémica y juega un importante rol en la lactancia, el parto, la conducta maternal y la formación de pareja. Adicionalmente, la OT es liberada por los axones terminales del NPV que se proyectan en  regiones del cerebro como hipocampo, cuerpo estriado y amígdala, implicadas en la regulación de la memoria, el estrés y la conducta social. La OT, además de su liberación a través de una sinapsis, también es liberada por somas y dendritas y puede alcanzar regiones cerebrales cercanas por difusión  a través del tejido neural.

La OT se une a receptores (OTR) acoplados a proteína G y activa la subunidad Gq para excitar la célula. Los estudios con autoradiografía han identificado la expresión de OTR  en varias regiones del cerebro de rata, incluyendo sistema olfatorio, ganglios basales, hipocampo, amígdala central e hipotálamo. El OTR también se encuentra  en neuronas serotonérgicas implicadas en  efectos ansiolíticos en depresión y ansiedad. La OT central  es importante en procesos homeostáticos  como la termorregulación, la ingesta de alimentos  y la conducta maternal. Ratas hembras  que reciben abundante cuidado materno exhiben niveles elevados  de OTR en regiones límbicas como  el núcleo del lecho de la estría terminal (BNST), el núcleo central de la amígdala (CeA), el septum lateral, el NPV y el área preóptica medial. Por otra parte, ratones hembras OT “knockout” (OTKO) tienen parto y conducta maternal normales  pero son incapaces de amamantar a sus crías, lo que demuestra que la OT no es necesaria para la conducta maternal o el trabajo de parto pero es esencial para la eyección de la leche. Los ratones machos OTRKO, a diferencia de los OTKO,  exhiben agresión aumentada. Es posible que la elevada conducta agresiva de los ratones OTRKO  sea mediada por la carencia de la señal OT en el CeA pues la administración  de OT en este núcleo disminuye la conducta agresiva. La localización regional de OTR varía entre las especies, Por ejemplo, ratones y humanos exhiben  diferente localizaciones de OTR, el OTR se localiza en hipocampo de ratones pero  en humanos el OTR no se localiza en esta área. Adicionalmente, la señal OT varía entre machos y hembras. Las ratas hembras tienen pocos OTR en el BNST, hipotálamo ventromedial y amígdala medial en comparación con las ratas machos.

La liberación  de OT por las neuronas del NPV y la presencia de OTR en este núcleo sugiere la posibilidad de que la OT pueda modular directamente el eje hipotálamo-hipófisis-adrenales (HHA). El eje HHA responde a los estresores y activa neuronas en el NPV las cuales incrementan la síntesis y liberación de  hormona liberadora de corticotropina (CRH). La liberación de CRH en el sistema porta hipofisiario aumenta la síntesis y liberación  de hormona adrenocorticotrópica (ACTH)  en la hipófisis anterior.  A su vez, la ACTH actúa sobre las glándulas suprarrenales para estimular la liberación  de glucocorticoides. Los aumentados niveles circulantes de glucocorticoides pueden inhibir la actividad del eje HHA  a través de receptores GR y MR en el cerebro y también actuar sobre sitios cerebrales específicos  para modular conductas. La OT puede impactar varios sitios en el eje HHA. Por ejemplo, las neuronas del NPV que se proyectan  a la eminencia media liberan OT en los vasos porta hipofisiarios para estimular la liberación adrenal de glucocorticoides, potenciando la acción de la CRH en la hipófisis anterior. Por el contrario, neuronas OT del NPV que se proyectan al cerebro anterior y liberan OT en respuesta a los estresores ejercen acciones ansiolíticas.  Los niveles endógenos de OT son suficientes  para alterar la reactividad del eje HHA.

La OT está implicada en la formación de pareja y en la conducta social, pero también puede jugar un rol en desordenes psiquiátricos como la ansiedad y la depresión.  El efecto de la OT en estos desordenes puede estar relacionado con la conducta social anormal, pero la OT puede también impactar independientemente estos desordenes  a través de la regulación del eje HHA.  La desregulación del eje HHA  y la respuesta aumentada a los estresores  ocurren frecuentemente en la ansiedad. En un estudio clínico con participantes pediátricos y adultos, los niveles de OT en plasma y líquido cerebroespinal fueron mayores en los participantes con menor ansiedad. Sin embargo, algunos estudios sugieren que los síntomas de ansiedad severa pueden estar relacionados con la activación del sistema OT. Por otra parte, niveles nocturnos disminuidos de OT han sido reportados en individuos deprimidos. A pesar de estas inconsistencias en los datos sobre los niveles de OT en trastornos psiquiátricos, un meta-análisis reciente sugiere que la OT puede tener efectos  beneficiosos en el tratamiento de la ansiedad y la depresión.

Las hormonas esteroides alteran la señal OT. Los esteroides constituyen una familia de hormonas  que incluye estrógenos, andrógenos, progestinas, mineralocorticoides y glucocorticoides. Estas hormonas cruzan rápidamente la membrana celular y se unen –y activan-  a sus respectivos receptores intracelulares, los cuales  tienen dominios de unión a ADN y ligando. Antes de la unión del ligando, el receptor es mantenido en estado inactivo  por un complejo de proteínas chaperonas.  Cuando ocurre la unión del ligando, el receptor se dimeriza y  se une a los elementos de respuesta del promotor de OT, recluta cofactores y maquinaria de transcripción  para promover la transcripción de genes. En el cerebro de ratón, los estrógenos pueden actuar de manera sinérgica con la OT para aumentar sus efectos ansiolíticos e incrementar los niveles de OTR. En humanos, una dosis única de estradiol es suficiente para incrementar los niveles plasmáticos  de OT en mujeres, la testosterona altera la expresión de OTR dependiendo de la región cerebral, la progesterona puede inhibir la unión de OT al OTR y el tratamiento con glucocorticoides sintéticos altera significativamente la expresión de OTR en amígdala, BNST e hipotálamo ventromedial. Por otra parte, la testosterona disminuye la actividad del eje HHA, mientras los estrógenos pueden incrementarla o disminuirla. Estas alteraciones pueden llevarse a cabo, al menos en parte, a través de modulaciones de la actividad OT. La diferencia en los efectos de los estrógenos sobre la conducta y la respuesta neuroendocrina al estrés puede estar relacionada con la actividad diferencial de los receptores de estrógenos ERα y ERβ. La activación de ERα puede estimular al eje HHA mientras la activación de ERβ tiene el efecto opuesto. El ERα modula la transcripción  de OTR mientras el ERβ altera los niveles de ARNm de OT. Más aún, la modulación  de OT por los andrógenos  es mediada en parte por un metabolito 3β-diol de la testosterona, el cual activa al ERβ para que se una al promotor OT e incremente los niveles de ARNm de OT.

Los receptores ERβ son expresados ampliamente en el cerebro y a menudo se superponen con la expresión de ERα. Aproximadamente 85% de las neuronas OT en el NPV co-expresan ERβ y la activación con agonistas específicos de ERβ o metabolitos 3β- diol de testosterona reduce la actividad del eje HHA La sustancial similitud en la distribución de ERβ y OT sugiere una interacción entre ambos en la regulación de la actividad del eje HHA. Estudios recientes han investigado la compleja interacción entre ERβ y promotor OT. El tratamiento  de neuronas del NPV con agonistas ERβ, 3β-diol o estradiol  incrementan los niveles de ARNm de OT y la ocupación del promotor OT. En presencia de 3β-diol, el ERβ se une al promotor OT y recluta al coactivador SRC-1 dependiente de ligando, el cual se une a la proteína ligadora  del elemento de respuesta de AMPc y forma un complejo funcional que acetila la histona H4  para manejar la expresión del gen OT.

En conclusión, la OT tiene un amplio rango de roles en el cerebro. Los datos actuales  indican que las neuronas OT del NPV proporcionan la principal inervación OTergica del cerebro anterior. La función de la OT, a través de OTR, es regionalmente específica, sin embargo, la localización de OTR varía con la edad y el sexo. Los moduladores del sistema OT, especialmente las hormonas esteroides, también proporcionan blancos reguladores adicionales pues la OT modula la reactividad del eje HHA y participa en diversas funciones.  En particular, el ERβ es expresado por muchas neuronas del NPV y su activación  incrementa la síntesis de OT y reduce la ansiedad y la actividad del eje HHA.

Fuente: Acevedo-Rodríguez A et al (2015). Oxytocin and estrogen receptor β in the brain: an overview. Frontiers in Endocrinology 6:160.

Señal antiobesidad de la amilina

Un prerrequisito para el control homeostático  de la masa grasa  es la existencia de hormonas periféricas que conjuntamente con aferentes nerviosas, envían el reporte del estado del balance energético  a los circuitos adipostáticos en el cerebro. Los efectos de estas señales son mediados, al menos en parte, por cambios en neurotransmisores, especialmente aquellos localizados en el hipotálamo. Es conocido que la leptina del tejido adiposo estimula neuronas que producen hormona estimulante de melanocitos α, mientras la ghrelina del estómago estimula neuronas  que producen neuropéptido Y/péptido relacionado con el agouti/ácido γ-aminobutírico. Estas dos poblaciones neuronales del núcleo arcuato median señales contrarreguladoras para la homeostasis energética. Adicionalmente, las hormonas que reportan el balance energético periférico pueden actuar sobre el tallo cerebral.

Como la leptina y la ghrelina, la amilina es un mensajero periferia-cerebro de importancia para el balance energético. La proamilina es liberada con la insulina por las células β del páncreas después de las comidas. La amilina reduce la ingesta de alimentos y el peso corporal y potencia los efectos de la leptina.  El análogo de amilina, pramlintide, usado clínicamente  para el tratamiento de la diabetes, disminuye el peso corporal por más de dos kilos en humanos, pero los mecanismos subyacentes aún no están claros.

Resultados publicados recientemente  indican que la IL-6 podría ser un mediador en el sistema nervioso central  de los efectos reductores  del peso corporal y la ingesta de alimentos de otro mensajero periférico del balance energético, el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), además de la amilina. Hay varias similitudes entre GLP-1 y amilina. (1) Ambos péptidos son liberados en el abdomen durante las comidas. (2) Ambos péptidos causan una modesta pero significativa disminución de la ingesta de alimentos y el peso corporal. (3) En dosis altas y tempranamente durante el tratamiento, ambos péptidos pueden inducir náuseas. (4) Ambos péptidos mejoran la homeostasis  de la glucosa  y son usados en el tratamiento de la diabetes. (5) Ambos péptidos disminuyen el vaciamiento gástrico y la secreción de glucagón, efectos que podrían contribuir  a mejorar el metabolismo de la glucosa.  (6) En el cerebro, ambos péptidos actúan sobre el área postrema en el tallo cerebral, pero también actúan sobre el hipotálamo.  Sin embargo, también hay diferencias, el GLP-1 es una incretina del intestino que actúa incrementando la secreción de insulina, mientras la amilina  es cosecretada con la insulina y potencia sus efectos.  El GLP-1, a diferencia de la amilina, también es producido por una población específica  de neuronas en el cerebro, el núcleo del tracto solitario en el tallo cerebral. Por otra parte, el GLP-1, a diferencia de la amilina,  actúa vía nervio vago o es, al menos en parte, dependiente del nervio vago para sus efectos.

Los resultados de estudios recientes demuestran que la amilina actúa a través de la citoquina IL-6 para disminuir el peso corporal e incrementar la sensibilidad a la leptina.  Estudios previos indican que la IL-6 es el mediador de los efectos anoréxicos y antiobesidad del GLP-1. Estos hallazgos no dejan de ser sorprendentes pues la IL-6 es conocida  por sus efectos en la defensa inmune. Sin embargo, La IL-6 ha sido implicada  en la caquexia producida por infecciones y cáncer y hay estudios que señalan que la IL-6 en el sistema nervioso central  juega un rol  en la supresión de grasa corporal en individuos sanos.  En ratones IL-6 KO alimentados con dieta baja en grasa se  observa  obesidad de inicio en la adultez  y este efecto parece ser ejercido a nivel del sistema nervioso central. Por otra parte, el bloqueo de la IL-6 puede inhibir los efectos beneficiosos del ejercicio sobre la sensibilidad a la insulina y la leptina.  En resumen, varios reportes indican que la IL-6 disminuye la obesidad  a través de sus efectos en el cerebro, resultados que están en consonancia con el rol mediador de la IL-6 en los efectos antiobesidad  de amilina y GLP-1.

La propuesta que el GLP-1 actúa incrementando la IL-6 a nivel del sistema nervioso central es apoyada por trabajos que demuestran que el GLP-1 en el intestino es liberado por las células L en respuesta  a la IL-6 y por lo tanto es mediador  de los efectos metabólicamente beneficiosos de la IL-6. Entonces, IL-6 y GLP-1 interactúan en varios  sitios del cuerpo y estas interacciones, en general, parecen promover  la salud metabólica. Adicionalmente, hay algunos reportes  sobre posibles interacciones entre IL-6 y amilina fuera del sistema nervioso central.

En conclusión, la amilina y el GLP-1 pueden actuar para disminuir el peso corporal  a través del incremento de la producción de IL-6  en diferentes partes del cerebro. Amilina y GLP-1 tienen varias características en común, ambos péptidos son secretados durante las comidas,  promueven  el almacenamiento  de nutrientes para mejorar el metabolismo de la glucosa y  disminuyen el peso corporal. Por lo tanto, no es sorprendente que análogos de ambos péptidos sean usados farmacológicamente para el tratamiento de la diabetes y, en el caso del GLP-1, para tratar la obesidad. Evidencias recientes sugieren que la amilina y el GLP-1 activan señales no canónicas en el hipotálamo, en la forma de IL-6 más que neuropéptido Y/péptido relacionado con el agouti y hormona estimulante  de melanocitos α, para la regulación  de la ingesta de alimentos, la masa grasa corporal y el peso corporal.

Fuente: Jansson JO y Palsdottir V (2015). Brain IL-6-where amylin and GLP-1 antiobesity signaling congregate. Diabetes 64:1498-1499.

Fisiología de la melatonina intestinal

La melatonina (5-metoxi-N-acetiltriptamina) es una  molécula cronobiótica  involucrada en la regulación de una variedad  de funciones fisiológicas.  Después de su descubrimiento en la glándula pineal de bovino, la melatonina ha sido detectada en varios tejidos/órganos como retina e intestino. La localización  de melatonina en las células enterocromafines  de la mucosa digestiva de rata fue seguida por su estimación cuantitativa en tejido intestinal. A nivel sub-celular, la unión más fuerte se notó en la fracción nuclear, seguida por las fracciones microsomal, mitocondrial y citosólica. En mamíferos, las células productoras de melatonina se encuentran  en las capas submucosa y muscularis de esófago, la porción glandular de la pared gástrica y en las criptas de Lieberkhun y las glándulas de Brunner del duodeno, específicamente en las células enterocromafines  de la capa mucosa. En general, las concentraciones de melatonina en los tejidos intestinales superan los niveles circulantes  10-100 veces.

La síntesis de melatonina  es un fenómeno de cuatro etapas. Primero, el precursor L-triptofano es tomado de la circulación  y convertido en 5-hidroxi-triptofano en las mitocondrias por la enzima triptofano-5-mono-oxigenasa/hidroxilasa y posteriormente descarboxilado  en el citosol por la descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos para formar serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) que, a su vez,  es acetilada (N-acetilación) en N-acetil serotonina por la arilalquilamina-N-acetiltransferasa (AANAT), considerada como la etapa limitante  en la ruta biosintética  de la melatonina. Finalmente, la N-acetil serotonina es O-metilada  por la hidroxiindol-O-metiltransferasa (HIOMT) para formar melatonina.  

El perfil circulante  de melatonina  exhibe ritmos diurnos precisos con un pico durante la fase de oscuridad y un nadir durante la fase de luminosidad, tales ritmos son generados primariamente  por la AANAT de la glándula pineal. La duración  de las fases de luminosidad y oscuridad  en un ciclo  de 24 horas  juegan un rol clave en la regulación de la síntesis de melatonina en la pineal. En los mamíferos, la luz es detectada  por la retina y afecta la glándula pineal indirectamente  con una ruta multisináptica.  A diferencia de la pineal, la síntesis de melatonina  en el intestino, no es un fenómeno dependiente de la  oscuridad y las condiciones de luz ambiental no tienen el rol  de factor externo en la determinación de sus características rítmicas en un ciclo de un día.

Una de las variables  periódicas en el intestino  es la disponibilidad de alimento, la cual puede servir  como un factor importante para determinar  la periodicidad diaria  de la síntesis de melatonina en el intestino.  Dependiendo de la frecuencia y el tiempo de la comida, varios metabolitos y hormonas circulantes presentan variaciones diariamente y estas variaciones dependen de si el animal  está alimentado, en ayunas o en inanición. Debido a que el tiempo de ingesta de alimentos es opuesto en fase entre las especies diurnas y nocturnas, la síntesis de melatonina en el intestino se correlaciona  con la alimentación  en varios animales.  Sin embargo, no existen hasta el presente estudios experimentales apropiados que apoyen la hipótesis  de un rol directo de la disponibilidad  de alimento  y el tiempo de su ingesta sobre  el sistema melatoninérgico intestinal.

La melatonina es un compuesto lipofílico que difunde rápidamente a través de las membranas biológicas y actúa de manera endocrina, paracrina y autocrina. Está involucrada en  la regulación de múltiples funciones, incluyendo el control  del sistema gastrointestinal. La acción de la melatonina en los músculos intestinales  puede ser directa o a través del sistema nervioso mientérico. La presencia de melatonina  en las vellosidades intestinales  indica que puede estar involucrada  en el transporte transmembrana  de iones y electrolitos. Los estudios experimentales  confirman que la melatonina  también inhibe  la contracción de músculos lisos en estómago, ileum y colon. En ratas, la melatonina afecta  el electro-miograma de la motilidad pre y postprandial, aunque tales acciones  se observan solamente  en la noche, cuando la concentración de melatonina en sangre  usualmente es alta. Es posible que la melatonina relaje los músculos gastrointestinales bloqueando específicamente  los receptores nicotínicos de acetilcolina.

La melatonina intestinal, además de su efecto relajante  de los músculos gastrointestinales, parece inhibir la acción de la serotonina. En este contexto, se ha demostrado un contrabalance entre serotonina y melatonina en el tracto gastrointestinal, con la melatonina funcionando como un antagonista fisiológico de la serotonina: altas dosis de melatonina  inhiben la contracción inducida por serotonina  de los músculos del tracto gastrointestinal y producen elongación intestinal. Por el contrario, dosis bajas de melatonina estimulan  la contracción intestinal con el consiguiente acortamiento del intestino. Por otra parte, varios estudios en mamíferos indican que la melatonina puede tener un rol protector  contra el desarrollo de ulceras gástricas. Se propone que la prevención de lesiones gástricas  inducidas por estrés o etanol en ratas probablemente se deba  al efecto anti-serotoninérgico de la melatonina. Adicionalmente, la protección contra lesiones inducidas por estrés  puede ser debida a la fuerte acción antioxidante  de la melatonina  y la restauración de la microcirculación. La acción de la melatonina  en la prevención o el tratamiento de la colitis, además de su efecto antioxidante, incluye la estimulación del sistema inmune. En ratas, la administración de melatonina incrementa significativamente el número y el tamaño de las placas de Peyer, el mayor tejido inmune del tracto gastrointestinal. El tratamiento con melatonina también mejora los síntomas de colon irritable.

En conclusión, hay razones para  argumentar que la melatonina intestinal lleva a cabo funciones endocrinas, autocrinas y paracrinas. Sobre la base de estudios en mamíferos el significado fisiológico  de la melatonina derivada del intestino parece ser único por sus acciones a nivel local. Durante décadas, la melatonina ha sido promovida  como una “cura mágica”  para el tratamiento o la prevención  de varios desordenes  fisiológicos como  envejecimiento,  agresión, depresión,  hipertensión arterial, estrés oxidativo, jet lag, etc. Sin embargo, aun no se cuenta con datos convincentes que demuestren que tales acciones también son atribuibles a la melatonina derivada del intestino.

Fuente: Mukherjee S y Maitra SK (2015). Gut melatonin in vertebrates: chronobiology and physiology. Frontiers in Endocrinology 6:112.

Rol del FGF21 en la regulación del gasto de energía

El tejido adiposo, funcionalmente puede ser dividido en dos depósitos principales, blanco y marrón. El tejido adiposo blanco  se caracteriza  por la presencia  de adipocitos grandes uniloculares cuya función principal es el almacenamiento de energía y la liberación de ácidos grasos  durante el ayuno y la inanición. El tejido adiposo marrón se caracteriza por la presencia de células más pequeñas con gotas de lípidos multiloculares. La principal función del tejido adiposo marrón es la producción de calor, la cual es activada a través de la función de la proteína desacopladora 1(UCP1). Como indica su nombre, la UCP1 desacopla la oxidación  a partir de la fosforilación y  dispara un ciclo  que produce calor. Además de los adipocitos marrones clásicos localizados principalmente en los depósitos interescapulares, existen otros adipocitos, similares a los marrones, llamados beige o brite que se encuentran principalmente en los depósitos de tejido adiposo blanco.  El origen de estas células, sin embargo, es materia de debate. Durante la exposición al frio el sistema nervioso simpático activa al tejido adiposo marrón a través de la secreción de catecolaminas que estimulan receptores adrenérgicos β3 en la superficie de los adipocitos.  En ratas, el tejido adiposo marrón  es responsable  de 80% del exceso de la producción de calor durante la exposición al frio. En recién nacidos humanos, el rol del tejido adiposo marrón  en la protección de la hipotermia ha sido muy apreciado. Estudios recientes demuestran que el tejido adiposo marrón también contribuye a la producción de calor en adultos humanos. La repetida exposición al frio provoca el reclutamiento  de grasa marrón en humanos  e incrementa el gasto de energía inducida por el frio. Varios factores incluyendo al  factor de crecimiento fibroblástico 21 (FGF21), activan la grasa parda. El FGF21  está involucrado en el reclutamiento de células  en el tejido adiposo marrón  y en la activación de la grasa parda endógena.

El FGF21 es miembro de la familia de factores de crecimiento fibroblástico (FGF), los cuales inicialmente  fueron implicados  en el desarrollo embrionario  regulando la proliferación y diferenciación  así como la morfogénesis de órganos. El espectro se ha expandido recientemente y actualmente se acepta  que la señal FGF juega un importante rol en la patogenia de varias enfermedades. Esto es especialmente cierto para el FG21, el cual es un nuevo blanco  terapéutico para la regulación del metabolismo del cuerpo.  El FGF21 fue clonado en el año 2000 como una citoquina hepática con función desconocida. Cinco años más tarde se demostró que el FGF21 es un importante factor en la regulación de la captación de glucosa en adipocitos maduros. La inyección sistémica  de FGF21 en animales reduce significativamente los niveles circulantes de glucosa y triglicéridos. Por otra parte, la sobre expresión de FGF21 causa  un marcado incremento de la ingesta de alimentos en condiciones  de abundante comida y grasas, lo que sugiere que el gasto de energía y/o la captación de nutrientes es inducida en estos animales. Estos hallazgos identifican al FGF21 como un regulador  de la utilización metabólica  de sustancias que contienen energía.

El FGF21 es expresado  en hígado, páncreas, corazón, tejido adiposo y músculo. En humanos, la expresión de FGF21 es inducida después del nacimiento en repuesta a la ingesta de leche  durante la succión del pezón a través de la acción de PPARα. En animales en condiciones de termoneutralidad, solamente el hígado expresa FGF21 en niveles  comparables a los de tejido adiposo marrón activado. La señal FGF21 utiliza la clásica ruta de señalización FGFR pero, a diferencia de otros FGF, no se une directamente al receptor. El FGF21 lleva a cabo su función a través del receptor transmembrana β-kloto, el cual es un co-receptor FGFR con alta expresión en  hígado, tejido adiposo y sistema nervioso central. Los ratones que carecen de β-kloto presentan defectos de desarrollo que incluyen retardo del crecimiento y reducción de los niveles de UCP1 en el tejido adiposo marrón, lo que sugiere que estos animales tienen menos gasto de energía. Dado que la actividad del tejido adiposo marrón es estrechamente regulada por el sistema nervioso simpático no está claro si los efectos sistémicos del FGF21 son debidos a una regulación autónoma de la actividad del tejido adiposo marrón o si este efecto es mediado por el sistema nervioso simpático. El efecto central del FGF21 ha sido demostrado mediante la inyección intracerebroventricular de FGF21, la cual similar a la inyección sistémica de FGF21, incrementa el gasto de energía, la captación  de nutrientes y la sensibilidad a la insulina. Sin embargo, la administración central de FGF21 falla en reducir el peso corporal y el tamaño del tejido adiposo, lo que sugiere que los efectos del FGF21 son mediados periféricamente y centralmente. Además de su función endocrina. El FGF21 puede tener funciones autocrinas y paracrinas.

Estudios recientes demuestran que la inyección de FGF21 en animales produce un incremento  de la masa de tejido adiposo marrón y concomitantemente un incremento en la expresión  de UCP1 en el tejido adiposo marrón, efecto que se pierde en condiciones de termoneutralidad.  Por otra parte, algunos estudios reportan que el efecto sobre la pérdida de peso  es retenido cuando el FGF21 es inyectado  en ratones UCP1KO, lo que sugiere que este efecto  es independiente de la activación del tejido adiposo marrón. Sin embargo, otros estudios reportan que el efecto del FGF21 sobre la pérdida de peso es mediado a través de la activación del tejido adiposo marrón. Dado que algunos efectos  del FGF21 son abolidos en los ratones UCP1KO, surge la pregunta sobre cómo el FGF21 reduce la pérdida de peso de manera independiente de la UCP1. Esto requiere un detallado análisis de la regulación del balance energético.  La mayoría de tejidos contribuye a la tasa metabólica y al consumo de oxigeno  de un organismo y en el estado adulto la mayoría de calorías ingeridas se pierde finalmente como calor. Por otra parte, la contribución de los diferentes tejidos a la tasa metabólica (independiente de ejercicio)  depende principalmente  del fondo genético y la temperatura ambiental. En este contexto, la pregunta es si el FGF21  actúa como una molécula de retroalimentación fisiológica  de los tejidos termogénicamente activos  para integrar información acerca de la capacidad disponible y si esta alteración sensibiliza a otros tejidos  a la acción del FGF21. Es bien conocido que la deficiencia genética de UCP1 induce obesidad en ratones que viven en termoneutralidad. La función UCP1  es el principal disparador  de la termogénesis en el tejido adiposo marrón  y la pérdida de  UCP1 produce una disminución del gasto de energía y por consiguiente obesidad. Sin embargo, varios estudios no comparten este paradigma y reportan que bajo ciertas condiciones la pérdida de UCP1 puede proteger contra la obesidad inducida por dieta. Sobre la base de estas diferencias, varios investigadores han estudiado la producción de calor adrenérgica independiente de UCP1 con resultados controversiales que sugieren que estos efectos podrían  ser debidos a incrementos en la termogénesis independiente de UCP1 en el tejido adiposo blanco. Hasta el presente no está claro cómo son regulados estos procesos termogénicos. El desacoplamiento a nivel de la membrana mitocondrial ha sido propuesto como posible mecanismo. 

En conclusión, los efectos metabólicos del FGF21 tienen amplia aceptación, pero los mecanismos  por los cuales el FGF21 regula la pérdida de peso  no son completamente conocidos. El FGF21 induce pérdida de peso  y reducción de algunos parámetros metabólicos claves en ratones UCP1KO. Mientras algunos de estos efectos son conservados  y por lo tanto son independientes de UCP1, otros son afectados. Es posible que bajo condiciones fisiológicas los efectos del FGF21  sean mediados principalmente por el tejido adiposo marrón a través de la UCP1, pero en condiciones anormales como la deficiencia de UCP1, estos efectos podrían ser mediados por otros tejidos.

Fuente: Straub L y Wolfrum C (2015). FGF21, energy expenditure and weight loss. How much brown fat do you need? Molecular Metabolism 4: 605-609.

Receptor sensible a glucosa en células β del páncreas

La insulina es el regulador más importante  del metabolismo de combustibles. La insulina controla el metabolismo de carbohidratos y también regula el metabolismo de otros nutrientes incluyendo aminoácidos, proteínas y lípidos.  Con relación al metabolismo de carbohidratos, la glucosa controla estrictamente la producción y la secreción de insulina y la elevación de la concentración  plasmática de glucosa aumenta la secreción de insulina. Por el contrario, la insulina mantiene la concentración plasmática de glucosa en un rango relativamente estrecho a través de la estimulación  de la síntesis de glucógeno en el hígado y la promoción de la captación de glucosa en músculo esquelético y tejido adiposo. Las células β del páncreas funcionan como sensores de combustibles y detectan cambios en las concentraciones plasmáticas no solo de glucosa sino también  de aminoácidos y lípidos incluyendo ácidos grasos. En este contexto, es bien conocido que las células β expresan en la superficie celular receptores acoplados a proteína G (GPCR) que detectan ácidos grasos de cadena larga y varios tipos de aminoácidos. Estos GPCR funcionan como sensores  de nutrientes en la superficie celular  y por lo tanto modulan la secreción  de insulina.  Dado que las células β expresan una variedad de GPCR para lípidos y aminoácidos, es  posible que también expresen GPCR que funcionen como sensores de azúcar.

El  glucoreceptor representa una molécula de la célula β que  une -y a la vez es   sensor de-  glucosa, transmite algunas señales en la célula y eventualmente  induce la exocitosis  de insulina a través de cambios  en el flujo de iones. Hay dos modelos principales de glucoreceptor, uno es el modelo sitio glucoregulador  y el otro es el modelo sitio sustrato. En el primer modelo, la glucosa se une al glucoreceptor en la superficie de la célula y activa la molécula receptora. Niki y colaboradores demostraron que las células β discriminan   anómeros  α y β de D-glucosa y que el anómero α es un estimulador más eficiente de la secreción de insulina que el anómero β. Ellos también demostraron que las células β reconocen anómeros α y β de manosa. Estos hallazgos son consistentes con la noción que las células β expresan una molécula  que reconoce la estructura fina  de los anómeros de hexosas.  Sin embargo, otros estudios reportan que las enzimas involucradas en la ruta glucolítica, como fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa, son capaces de discriminar anómeros de glucosa. Estos investigadores postularon  que la naturaleza del glucoreceptor  es una enzima que cataliza glucosa (modelo sitio sustrato). Dado que la conversión intracelular  de anómero α en anómero β es bastante rápida, es difícil asumir que  las enzimas glucolíticas puedan ser responsables  del efecto preferencial  del anómero α sobre el anómero β en la secreción de insulina inducida por glucosa.  Por otra parte, existe una similitud entre las células β del páncreas y las células gustativas de la lengua en términos del reconocimiento  de glucosa. En las células gustativas de la lengua, las moléculas dulces como los azucares son reconocidas  por una molécula receptora de la superficie celular, el receptor del sabor dulce. Este receptor es capaz de discriminar anómeros α y β de hexosas,  la α-D-glucosa es más dulce que la β-D-glucosa. Las células β de los islotes pancreáticos expresan en la superficie celular una molécula  que reconoce glucosa y otros azucares  de una manera similar al glucoreceptor de las células gustativas. Este glucoreceptor modifica el metabolismo de glucosa y aumenta la producción de ATP. Más aún, el glucoreceptor, una vez activado, induce cambios en el flujo de Ca²⁺, incrementa niveles de AMPc y activa la C-quinasa.

El receptor para el sabor dulce  es expresado en las células gustativas  de las papilas linguales  y detecta sustancias dulces en la cavidad oral. Este receptor es un sensor de moléculas dulces, como  azucares incluyendo sucrosa, glucosa y fructosa. También es sensor de aminoácidos dulces, proteínas dulces y varios edulcorantes artificiales con diversas estructuras químicas. Estructuralmente es un heterodímero  de T1R2 y T1R3, los cuales pertenecen  a la clase C  de GPCR.  En las células β del páncreas, sin embargo, a diferencia de las células gustativas de la lengua,  el receptor parece ser un homodímero de T1R3 más que un heterodímero. Estudios inmunohistoquímicos han detectado el T1R3 en células β de islotes pancreáticos de ratón y también en las células MIN6, productoras de insulina. La estimulación de T1R3 con el edulcorante artificial sucralosa resulta en un incremento en la secreción de insulina en islotes pancreáticos de ratón y en células MIN6. En las células β, el T1R3 está acoplado a Ca²⁺ y AMPc. Actualmente, está claro que el T1R3 está involucrado en la acción de la glucosa en las células β del páncreas y que el T1R3  es activado por glucosa en concentraciones fisiológicas. Por lo tanto, el T1R3 ha sido designado como “receptor sensible a glucosa”.

Los datos  de  estudios en roedores han permitido un  nuevo modelo para la acción de la glucosa en las células β del páncreas. Según este modelo, la glucosa  primero actúa en la superficie celular sobre el receptor sensible a glucosa, T1R3, lo cual genera una señal para facilitar el metabolismo  en las mitocondrias. Luego, la glucosa entra a la célula β a través de transportadores  de glucosa (GLUT2) y es metabolizada  a través de la ruta facilitada por el T1R3.  Un punto importante  en este modelo es que la glucosa ejerce  su efecto actuando sobre dos rutas, y ambas rutas  actúan sinérgicamente  para estimular la secreción de insulina. El nuevo modelo incluye al modelo clásico, el cual establece que  el efecto de la glucosa es dependiente de su metabolismo. También  es consistente con observaciones previas que demuestran que la inhibición del metabolismo de la glucosa  bloquea la secreción de insulina inducida por  glucosa. Sin embargo, en el nuevo modelo la actividad completa de la glucosa  también depende de la señal del receptor sensible a glucosa.  Adicionalmente, el nuevo modelo señala  que cualquier incremento  en la expresión de T1R3  podría aumentar la secreción de insulina  inducida por glucosa.  Los estudios sobre la expresión de los niveles de T1R3 en las células β demuestran cambios significativos que dependen del estado nutricional.  Por ejemplo, en ratones, la expresión  de T1R3 en las células β es alta en el ayuno y disminuye rápidamente  después de la ingesta de alimentos.  En otras palabras, la expresión de T1R3 es alta cuando la ingesta de carbohidratos  es requerida.  Consistente con este cambio, la cantidad de insulina  secretada  en respuesta a la glucosa es mayor en el estado de ayuno que en estado alimentado.  Por otra parte, el T1R3 expresado en las células β muestra cambios diurnos  dependiendo del tiempo de alimentación. Desde un punto de vista fisiológico, es razonable esta regulación pues una gran cantidad de  insulina es secretada  cuando la demanda de ingesta de carbohidratos es alta.  En ratas con diabetes tipo 2, la expresión de T1R3 es reducida pero se recupera cuando los animales son tratados con insulina. Este resultado sugiere que la exposición crónica de las células β a la hiperglucemia regula hacia abajo a los receptores T1R3. En cualquier caso, la expresión de T1R3 es afectada por varios estados nutricionales y metabólicos.

La activación del T1R3 incrementa la concentración intracelular de Ca²⁺ y AMPc. La elevación de Ca²⁺ depende grandemente de la entrada del ion  a través de canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC). La entrada de Ca²⁺  también es dependiente  de Na⁺. Presumiblemente, la activación  de T1R3  estimula la entrada de Na⁺ a través de canales permeables a Na⁺. La despolarización resultante causa la activación de VDCC. El T1R3 incrementa la concentración de AMPc presumiblemente  por activación de Gs. Las señales intracelulares  generadas por el T1R3 son diversas y dependen del tipo de agonista y del tipo de célula  que expresa el receptor. Es conocido que el T1R3 es expresado  en muchos tipos de células  que regulan el metabolismo energético y las señales intracelulares  producidas por las moléculas dulces deben ser evaluadas con precisión. Presumiblemente, diferentes agonistas activan diferentes  tipos de proteínas G y activan efectores dependiendo de los cambios conformacionales  inducidos por la unión de los agonistas.

En conclusión, presumiblemente un homodímero de T1R3  podría funcionar como receptor sensible a glucosa en la superficie de las  células β de los islotes pancreáticos y participar en la acción de la glucosa  sobre la secreción de insulina. . La activación de este receptor  promueve el metabolismo en las mitocondrias y produce un incremento en la concentración intracelular de ATP. La glucosa promueve su propio metabolismo a través de la activación del T1R3.  Entonces, el T1R3  está involucrado en la acción de la glucosa y modula el metabolismo de glucosa en las células β del páncreas.

Fuente: Kojima I et at (2015). Return of the glucoreceptor: glucose activates the glucose-sensing receptor T1R3 and facilitates metabolism in pancreatic β-cells. Journal of Diabetes Investigation 6: 256-263.