Selectividad funcional de  agonistas de receptores acoplados a proteína G

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) procesan una variedad  de señales extracelulares relacionadas con la cognición, los sentidos, el control hormonal y metabólico, la regulación cardiovascular y el sistema inmune, y transmiten  esta información a rutas de señalización intracelular. Este sistema de  señalización está formado principalmente por GPCR, proteínas G y efectores. Los GPCR son codificados por 1000 genes aproximadamente y representan una de las familias  más grandes en el genoma humano. La proteína G consiste  de las subunidades Gα, Gβ y Gγ codificadas por genes separados a partir de un “pool” de  genes de al menos 16 Gα, 6 Gβ y 12 Gγ. Este pool  potencialmente permite aproximadamente 1000 variaciones  del complejo proteína G (Gα/Gβ/Gγ). Las proteínas G regulan aproximadamente 100 efectores diferentes. En contraste con esta diversidad, el mecanismo molecular que subyace a la activación dependiente  de GPCR de las proteínas G ha evolucionado  de  una manera conservadora entre las diferentes especies. En los últimos 20 años, se han reportado muchas mutaciones activadoras o inactivadoras de GPCR o proteínas G como causas subyacentes  de diferentes enfermedades. Los análisis de las mutaciones han revelado no sólo las rutas moleculares de muchas enfermedades sino también  los mecanismos fisiológicos de los GPCR.

Las redes de señalización  GPCR comprenden los GPCR, las proteínas G y los efectores. En algunos casos, cada eje GPCR-proteína G-efector trabaja independientemente. En otros casos,  múltiples GPCR se acoplan a una proteína G produciéndose una señal convergente. Asimismo, se han reportado muchos ejemplos con un GPCR acoplado  a múltiples proteínas G, produciéndose una señal divergente. En el modelo clásico, un agonista interactúa con un GPCR que se acopla con múltiples proteínas G y se activan múltiples rutas de señalización  relacionadas con estas proteínas G. En este modelo, para que se active solamente una ruta de señalización, un agonista necesita aparearse con un GPCR que se acople específicamente  con una sola proteína G. Recientemente, ha ganado aceptación un nuevo concepto, en el cual un agonista  puede activar una ruta de señalización especifica a través de  un GPCR involucrado en múltiples rutas de señalización. Este concepto es conocido  como selectividad funcional. Un modulador alostérico  que media los efectos del agonista,  y actúa en un sitio del GPCR diferente al sitio de interacción del agonista, puede aumentar o atenuar las señales o en algunos casos puede activar rutas de  señalización específicas. 

Dos conceptos han recibido mucha atención en la última década. El primero de ellos, conocido como “eficacia pluridimensional”, reconoce que los GPCR interactúan tanto con  proteínas G como con proteínas no G. Esto representa el reconocimiento de redes de señalización independientes de proteína G y revela la verdadera eficacia  de los GPCR.   Los efectores no proteína G mejor caracterizados son las arrestinas, una familia de cuatro proteínas citoplasmáticas conocidas inicialmente por su rol en la desensibilización  de los GPCR  y en la modulación de la fototransducción.   Las arrestinas se unen a receptores ocupados por agonistas que han sido fosforilados por  las kinasas de GPCR y producen desensibilización homóloga del receptor. En el caso de las arrestinas no visuales, arrestina 2 y 3 (β-arrestina 1 y 2), el extremo C terminal de la arrestina se une a elementos de la maquinaria endocítica, provocando el secuestro de los receptores desensibilizados. Las arrestinas también reclutan proteínas  e inician una “segunda onda”  de señalización que transita los compartimentos intracelulares. Los efectores regulados por arrestinas  incluyen a la familia de kinasas Src, a componentes de la cascada MAPK,  la ligasa de ubiquitina, las fosfodiesterasas de AMPc, la diacilglicerol kinasa y la proteína fosfatasa 2A, entre otros. Aunque la importancia fisiológica de la señal arrestina no está aún aclarada completamente, la evidencia acumulada  indica que la señal GPCR dependiente de arrestinas interviene en funciones como degradación de segundos mensajeros, regulación de la dinámica del citoesqueleto, control de tráfico de vesículas,  exocitosis y  migración celular, y promoción de supervivencia, crecimiento e hiperplasia celular.

El segundo concepto crítico es la formulación de un modelo alostérico general de la señal GPCR. Ligandos estructuralmente distintos pueden activar al mismo GPCR de maneras diferentes, algunas de las cuales sólo pueden ocurrir si hay más de un estado activo del receptor. Los estudios bioquímicos y biofísicos proporcionaron la evidencia de que los GPCR adoptan múltiples estados activos que acoplan al receptor  a diferentes efectores con diferente eficiencia. El modelo alostérico  visualiza a los GPCR como “ensambles” de conformaciones terciarias. En cualquier momento, la actividad biológica del sistema refleja la distribución de la población de receptores a través de cada uno de los micro estados  que forman el ensamble conformacional. Cualquier interacción molecular que cambia la energía del sistema tiene el potencial para para afectar el ensamble conformacional  de manera tal que afecta también  la señalización. Consideradas como proteínas alostéricas, los GPCR son susceptibles a numerosos impulsos que modifican sus propiedades de señalización. Además de los efectos ortostáticos ejercidos a través del sitio de unión del ligando, los efectos alostéricos laterales que provienen de las interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática o el citoplasma y las modulación alostérica que proviene de la interacción  de moléculas pequeñas con sitios externos a la unión del ligando, también afectan la señalización. Los conceptos de “selectividad funcional” y “agonismo sesgado” emergen de los principios  de eficacia pluridimensional y modelos alostéricos  de la eficacia de los GPCR para producir una descripción comprensible  de la conducta ortostática del ligando.  

En el modelo clásico de activación  de los GPCR  se asume que los estos receptores existen en equilibrio entre un estado activo y un estado inactivo. Este modelo de dos estados a menudo es usado para explicar muchos de los fenómenos relacionaos con la activación y la inactivación de los GPCR. En este modelo, por ejemplo, los GPCR son activados en varias frecuencias sin la estimulación por parte del agonista. Esto explica porque, cuando son expresados, estos receptores muestran actividad basal. En este modelo clásico, se postula que los agonistas desvían el equilibrio del GPCR hacia la forma activa mientras que los agonistas inversos hacen lo contrario, y que los antagonistas inhiben competitivamente a los agonistas sin afectar el equilibrio.  Sin embargo, varias líneas de evidencia apoyan un modelo alternativo multi-estado de los GPCR, en el cual estos receptores  pueden adoptar espontáneamente múltiples estados conformacionales, activos e inactivos. En este nuevo modelo,  cada ligando reconoce y estabiliza una conformación específica del GPCR, produciéndose un conjunto de efectos biológicos únicos y específicos.  Un agonista funcionalmente selectivo (agonista sesgado) es definido en este caso como una droga única que reconoce y estabiliza una conformación quimérica que es “on” con respecto a una ruta de señalización y “off” para otra. Esto provoca la activación  de una ruta de señalización  específica a través de  un GPCR que activa múltiples señales.

Algunos  ejemplos que apoyan el modelo multi-estado de los GPCR son los siguientes: el receptor de PACAP, PACAPI-27  muestra eficacia relativamente alta  para la acumulación  de AMPc y relativamente baja  para el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) en comparación con  el receptor PACAPI-38 en las células que expresan receptores PACAP transitoriamente. Esto sugiere que la activación de múltiples mecanismos de señalización por  un agonista no es uniforme sino que a menudo se inclina  hacia alguna -pero no todas-  ruta de  señalización y que los estados agonista-selectivos pueden producir un agonismo sesgado. Los hallazgos de investigaciones recientes apoyan este concepto, incluyendo los cambios conformacionales  específicos de ligando  del receptor adrenérgico β2. Por otra parte, en el caso del receptor de hormona paratiroidea (PTHR), es conocido que activa las rutas Gs/adenil ciclasa y Gq/fosfolipasa C,  pero la PTH no puede activar la adenil ciclasa aun cuando  retiene la capacidad para activar la ruta ERK1/2, posiblemente vía Gq, en osteoblastos de rata. Asimismo, en el caso de los receptores de taquikinina (NK2R), el péptido NKA incrementa el calcio intracelular y la acumulación de AMPc en algunas células  mientras que solo incrementa el calcio intracelular sin respuesta AMPc en otras, lo que sugiere  dos estados conformacionales distintos.  En este contexto es muy importante determinar si el agonista normal y el agonista sesgado actúan sobre el mismo GPCR.  

El receptor sensor de calcio (CaSR) pertenece a la familia C de GPCR  y contiene un dominio heptahélice  que juega un papel clave en el acoplamiento con la proteína G y un dominio que atrapa al agonista. El CaSR es constitutivamente dimerizado  a través de puentes disulfuro entre los residuos cisteína120 y 131, un evento que subyace a la propia funcionalidad del CaSR. La regulación alostérica es una de las características importantes del CaSR. Los moduladores alostéricos positivos del CaSR son conocidos como calciomiméticos  y los moduladores alostéricos negativos  como calciolíticos. Los calciomiméticos no activan al CaSR en ausencia  de iones Ca²⁺, pero aumentan la sensibilidad  a estos iones. El CaSR muestra al menos dos conformaciones activas diferentes, una forma unida al calcio que se acopla con Gq/11 y Gi/o y una forma unida a calcio que se acopla específicamente a Gq/11. Un calciomimético opera como un modulador alostérico positivo de Gq/11 y de la fosforilación de ERK 1/2 dependiente de Gi/o.

En la investigación sobre el agonismo sesgado  de las rutas GPCR  se ha demostrado que los ligandos del receptor adrenérgico β2 funcionan como agonistas inversos en la ruta Gs-AMPc y como agonistas parciales en la fosforilación de ERK ½. Este hallazgo sugiere que un ligando sesgado único  para un GPCR específico puede trabajar como agonista y agonista inverso dependiendo de cual ruta de señalización  es  considerada.   En un sistema que expresa GPCR redundantes y plurales en vez de expresar un par GPCR/agonista específico, un agonista sesgado específico o un modulador  alostérico sesgado pueden llevar a cabo una regulación más rápida y flexible de las señales.

Un caso especial de selectividad funcional basada en GPCR es el agonismo “protean”, en el cual ciertos agonistas pueden cambiar o incluso revertir sus efectos dependiendo  de los estados  o sistemas  adoptados. Por ejemplo, en un sistema quiescente que contiene principalmente receptores en un estado inactivo, algunos agonistas pueden producir agonismo selectivo.  Por el contrario, en un sistema constitutivamente activo que involucra sustancialmente receptores en estado activo formados espontáneamente, los mismos  agonistas puede producir agonismo inverso. Esto se debe a que estos agonistas convierten el estado activo eficiente en un estado activo selectivo de ligando menos eficiente. Debido a que el efecto del ligando cambia en respuesta al sistema, estas moléculas fueron llamadas agonistas “protean” en alusión a Proteus (hijo de Poseidon) quien podía cambiar su forma dependiendo de su ambiente y sus necesidades.  Como ejemplos, se mencionan a los ligandos del receptor de histamina H3 que operan en agonismo o agonismo inverso, dependiendo  del nivel de actividad constitutiva del H3R y a los antagonists del receptor de vasopresina V2 que actúan como chaperonas farmacológicas  para inactivar receptores V2 mutantes y también actúan como agonistas inversos  de receptores V2.

En conclusión, el modelo clásico  de activación de los GPCR  es el modelo de dos estados, en el cual el GPCR existe en equilibrio entre un estado activo y otro inactivo. Los conceptos emergentes de eficacia pluridimensional y selectividad funcional han revelado que la señal GPCR no es monolítica y que la estructura del ligando puede desviar la señal estabilizando los estados activos del receptor  en proporciones diferentes a las del ligando natural. Los agonistas sesgados  poseen la capacidad de cambiar cuantitativamente la señal GPCR creando “nuevos receptores” con distintos perfiles de eficacia  manejados por la estructura del ligando. Los GPCR y sus ligandos naturales controlan la señalización intracelular de la manera más fisiológicamente adaptativa. La señalización, reflejada en la distribución  de estados activos  del GPCR y la eficiencia con la cual estos estados regulan los efectores es “balanceada”  según las necesidades del organismo. Los agonistas sesgados, por otra parte, alteran la distribución de estados activos, las señales resultantes no son cuantitativamente diferentes, pero son “desbalanceadas” en comparación con el ligando natural. Cuando estas señales desbalanceadas se propagan surgen diferencias en la respuesta tisular en la fuerza de la señal o en la cinética  de las rutas de activación y desactivación.

Fuente: Makita N y Liri T (2014). Biased agonism: a novel paradigm in G protein-coupled receptor signaling observed in acquired hypocalciuric hipercalcemia.  Endocrine Journal 61: 303-309.

El lenguaje de los receptores nucleares

El ADN del genoma de los eucariotes -y las histonas- forman estructuras de orden superior  de la cromatina, con el nucleosoma como unidad básica de aproximadamente 146 bp de ADN  alrededor de  un octámero  de histona. La cromatina es un importante regulador  de diversos procesos biológicos como la replicación del ADN, la reparación del ADN, la división celular y la transcripción. La estructura de la cromatina puede ser modificada  a través de muchos mecanismos, incluyendo modificaciones químicas del ADN o las histonas, sustitución  de histonas clásicas por variantes de histonas en el nucleosoma y  reposición de nucleosomas.  Entre los factores que se unen al ADN, como factores de transcripción (activadores o represores), se encuentran los receptores nucleares (RN) que actúan como sensores moleculares de estímulos fisiológicos y ambientales. En respuesta a diversas señales –esteroides, intermediarios metabólicos y toxinas químicas-  los RN  regulan rutas metabólicas, reproductivas y circadianas o contribuyen a estados patológicos como inflamación, obesidad y cáncer.  Hasta el presente, la familia de RN comprende 48 miembros en humanos, los cuales median la transcripción de genes  a través  de distintos mecanismos, incluyendo las clásicas actividades de transactivación y transrepresión.  Clásicamente, los RN se unen a secuencias específicas  de ADN y reclutan cofactores que modifican la estructura de la cromatina, la cual a su vez modula el reclutamiento y la actividad  de la ARN polimerasa para reprimir o aumentar la transcripción.  Sin embargo, los RN también pueden modular diferentes rutas  de una manera no genómica y su actividad puede ser influenciada por modificaciones post-translacionales (acetilación, fosforilación, sumoilación y ubiquitinación), lo cual los convierte en blancos de otras rutas celulares. 

A pesar del amplio rango de actividades, los RN tienen una estructura organizacional común que consiste en un dominio N-terminal regulador, el cual contiene la función  activación independiente  de ligando 1 (AF1) que usualmente tiene actividad transcripcional muy débil (con la notable excepción del RA), pero es capaz  de actuar sinérgicamente  con otro dominio de activación, función activación  2 (AF2), presente en el dominio de unión con el ligando (LBD). El dominio más conservado es el dominio de unión al ADN (DBD), el cual contiene  el P-box, responsable  de la interacción directa con el ADN y la especificidad de unión al ADN. El DBD tiene dos dedos de cinc que reconocen los elementos de respuesta  específicos del NR en las regiones reguladoras de sus genes blanco.  Los RN pueden unirse a los elementos de respuesta  localizados  en la proximidad de los promotores de los genes blanco y a elementos más distales, como monómeros, homodímeros (RG, RE y RA) o heterodímeros con el receptor retinoide X (RXR).  Los elementos de respuesta específicos  tienen dos “core” hexaméricos separados por un número variable de nucleótidos. El DBD también tiene una interface de dimerización  que puede ser el sitio de modificaciones post-translacionales que resultan en efectos diferentes para los diferentes RN. En algunos RN, la fosforilación del DBD resulta en disminución  de la unión al ADN (TRH, RE); en otros incrementa la unión al ADN y el reclutamiento de co-activadores. El DBD y el LBD C-terminal  están conectados por un dominio flexible  llamado región bisagra. EL LBD presenta una estructura hidrofóbica para el reconocimiento del ligando,  también contiene el dominio AF2, cuya acción depende de la presencia  del ligando unido así como sitios  responsables de la dimerización y regiones de unión de co-rereguladores.  

Para la mayoría de RN, la unión del ligando es el evento crítico que cambia su estado inactivo por un estado activo mediante la inducción de un cambio conformacional en el LBD. La conformación activa  permite la segunda etapa de la activación del RN; el reclutamiento de complejos co-reguladores. Muchos de estos cofactores funcionan como factores remodeladores  de la cromatina y catalizan las modificaciones de las histonas. Pequeñas modificaciones  de la estructura del ligando afectan la interface  de unión del co-activador, proporcionando una base molecular  para la especificidad y potencia  de la unión del ligando al RN. El LBD  es también un blanco  para modificaciones post-translacionales, las cuales gobiernan  una variedad  de funciones celulares, incluyendo la actividad del RN, la afinidad de unión al ADN, la sensibilidad del ligando, la estabilidad  y  distribución subcelular del receptor. Por lo tanto, las modificaciones post-translacionales  del RN pueden en última instancia resultar  en incremento o  disminución de la expresión  del gen blanco o en la transrepresión  de otras rutas.

Sobre la base de las propiedades de unión de los ligandos, los RN se pueden dividir en tres clases: RN hormonales, RN metabólicos y RN “orfan”. Los RN hormonales  a menudo se localizan en el citosol. Una vez que se unen a su ligando, ellos son translocados  al núcleo, usualmente como homodímeros, y se unen a los elementos de respuesta de RN. Los miembros de esta subfamilia incluyen al receptor de andrógenos (RA), estrógenos (RE), glucocorticoides (RG) y  progesterona (RP) y los ligandos incluyen hormonas lipídicas. Algunos RN hormonales como el ER y el GR forman complejos ligando-receptor que se unen al ADN en sitios reguladores del gen blanco. Otros RN (ER y PR) se unen a la cromatina y atraen factores coactivadores que tienen propiedades remodeladoras de la cromatina.  La unión al ADN y la remodelación de la cromatina aumentan el reclutamiento y/o función  de la maquinaria general de transcripción.  Los receptores metabólicos se localizan típicamente en el núcleo, se unen al ADN principalmente como heterodímeros  con el receptor retinoide X (RXR). En ausencia de ligando, ellos a menudo forman complejos en la cromatina con proteínas co-represoras. En este caso, los ligandos que se unen  al RN causan la disolución  del co-represor y reclutan proteínas co-activadoras.  Proteínas adicionales de la maquinaria basal de transcripción, incluyendo la ARN polimerasa II, son reclutadas por el complejo RN-ADN para iniciar el proceso de transcripción.  Los miembros de esta subfamilia incluyen  FXR, LXR, PPAR y otros, y entre los ligandos de este subgrupo  están  los lípidos de la dieta. El tercer subgrupo de RN  es la familia de receptores “orfan”, cuyos ligandos reguladores son aún desconocidos, incluso pueden no existir o bien  son candidatos que  recientemente  han sido identificados (orfan adoptados). Los miembros de este subgrupo incluyen los factores de transcripción  de la ovoalbúmina de pollo, el ERBA-α/β, el homologo de receptor hepático-1 (LRH1) y otros.

Los cromosomas están organizados como un estado de condensación continuo y los estados de compactación de la cromatina modulan la accesibilidad de los factores de transcripción (FT) al ADN subyacente. Generalmente, la heterocromatina condensada restringe la transcripción de genes, suprime la recombinación cromosomal y estabiliza centrómeros y  telómeros.  Por el contrario, la eucromatina es relativamente descondensada y rica en regiones que codifican genes y elementos transcriptos activamente. Entre los dominios eucromáticos y heterocromáticos  existen regiones discretas de cromatina altamente descondensada asociada con elementos reguladores activos (promotores, aumentadores, silenciadores, etc). Las histonas nucleosomales, H2A, H2B, H3 y H4, experimentan modificaciones post-translacionales de residuos en el extremo N-terminal, principalmente. Estas modificaciones (acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación), programan señales de  activación o  silenciamiento dependiendo de la modificación química específica y del residuo de la histona. Por ejemplo, la acetilación de histonas generalmente está asociada  con elementos reguladores activos e incluye la modificación de lisinas especialmente en las colas de H3 y H4. Por otra parte, La metilación de histonas está asociada con  activación y represión, dependiendo  del residuo modificado y el número de grupos metilos incorporados. Por ejemplo, la mono, di y trimetilación  de la lisina 4  de la H3 están asociadas con promotores activos.

Los RN de los esteroides  son expresados selectivamente  en distintos tipos de tejidos y regulan genes de una manera altamente específica. Estos receptores tienen el potencial para interactuar con cientos o miles  de sitios en el genoma de los mamíferos. Sin embargo, los experimentos de inmunoprecipitación  de cromatina  han demostrado que los receptores de los esteroides tienen un perfil de unión muy restringido, y una gran cantidad de secuencias de unión en el ADN permanece desocupada.  Por otra parte, por mucho tiempo se ha aceptado que la activación del RG induce la remodelación de novo de la cromatina, pero estudios recientes sugieren que esa no es la característica predominante de la activación de los RG. De acuerdo con esos estudios, la mayoría de eventos  de la unión de GR ocurren en elementos reguladores pre-existentes en el estado basal. Entonces, hay dos distintas clases de interacciones de los GR con la cromatina: el primer –y predominante-mecanismo involucra la unión en regiones accesibles de la cromatina en el estado no estimulado de la célula, mientras que la segunda clase de interacción   es mediada  vía mecanismo clásico de remodelación de cromatina dependiente  de receptor.  En células de mamíferos, más de 70% de la unión de GR está asociado con cromatina abierta pre-existente y aproximadamente 20% de la unión  de GR ocurre en cromatina cuya remodelación es inducida por hormona. Estas clases de interacción FT-cromatina han sido validadas con otros RN.  El establecimiento de cromatina abierta  en el estado no estimulado está determinado  por la presencia de complejos multiproteicos que incluyen FT, cofactores y complejos remodeladores de cromatina que colectivamente modifican la accesibilidad  de la cromatina.

Los coactivadores  asociados a un RN tienen importantes roles biológicos y actúan como potentes reguladores  de la respuesta al estrés metabólico y hormonal. El reclutamiento de acetiltransferas, como la p300, por un RN a través  interacciones proteína-proteína directas representa un mecanismo general de inducción de expresión de genes. Estas actividades enzimáticas acetilan histonas en elementos reguladores y promotores de los genes blanco tanto de manera dependiente de hormona como independiente de hormona.  Aunque un RN puede tener cientos de genes blanco y unirse a miles  de elementos reguladores, el uso de un coactivador único no es universal. Por ejemplo, en la ruta de señalización  del RA solo 50%  de los genes regulados por andrógenos dependen de la acetiltransferasa p300. Además de las acetiltransferas, los RN interactúan  con  -y reclutan-    metiltransferasas de histonas. Los mecanismos que gobiernan  el reclutamiento selectivo y la acción de los activadores no están muy claros. La fosforilación  del RN modifica las interacciones  con los cofactores y restringe el reclutamiento de coactivadores. La presencia de distintas modificaciones de las histonas también podría proporcionar señales para reclutamientos específicos  de los RN. La secuencia de ADN de los elementos reguladores individuales también interviene en el reclutamiento específico  de cofactores. 

El reclutamiento de corepresores es un mecanismo primario mediante el cual los RN median la represión transcripcional. Diversas proteínas corepresoras  interactúan con los Rn, incluyendo desacetilasas de histonas. El RG recluta complejos corepresores  en  secuencias de ADN asociadas  con regulación negativa y en sitios de transrepresión, donde el RG actúa de una manera independiente  de ADN reclutando desacetilasas  de histonas. Algunos RN en su estado basal sin ligando estabilizan complejos corepresores en la cromatina para silenciar  genes blanco. La metilación del ADN es un mecanismo epigenético para silenciar genes.  La acción del RN en la desmetilación de ADN no está muy claro. Sin embargo, la unión de receptores a los elementos reguladores en la cromatina abierta  coincide con ADN hipometilado. La evidencia reciente ha demostrado que los RN pueden regular dinámicamente  el estado de metilación  de ADN.

Los remodeladores de cromatina modifican los contactos  nucleosoma-ADN y son reclutados por los RN. Los mecanismos a través de los cuales los remodeladores de cromatina interactúan con los nucleosomas  no son muy claros actualmente. Los modelos propuestos sugieren que los remodeladores de cromatina interactúan directamente con los nucleosomas   través de residuos de histonas modificados. Alternativamente, los FT, como RG y RE, pueden reclutar activamente  remodeladores  de una manera condicional. En la inducción y represión  mediadas por RN, los remodeladores de cromatina pueden  actuar para mantener accesible la cromatina por factores de unión al ADN inducibles, por lo que  la activación o represión  de la transcripción  es mediada a través del   reclutamiento  de cofactores activadores   o represores.  Todos estos modelos implican un rol crítico para los complejos remodeladores de cromatina en la unión  del RN al ADN. La perdida de la actividad  remodeladora de la cromatina  por inactivación mutacional  en cánceres reorganiza  la unión  de RN,  con el resultado  de silenciamiento o activación   de genes relacionados con enfermedad.

Los RN como factores inducible por estímulo interactúan directa o indirectamente con FT inducibles –o unidos constitutivamente- en los elementos reguladores. Estas interacciones regulan la estructura de la cromatina local y modulan las respuestas transcripcionales. Las interacciones entre FT son un principio general de las redes reguladoras y representan una propiedad general de la cromatina en las células eucariotas.  Los receptores  de hormonas esteroides (RG, RA, RE) pueden homodimerizarse, unirse a los elementos de respuesta e interactuar con FT para modular la transcripción de genes a través de interacciones aditivas, sinérgicas o antagónicas.  Alternativamente, estos receptores pueden unirse  como monómeros e interactuar indirectamente  con FT unidos a los elementos reguladores. Otros RN, como el receptor hepático X y el receptor de ácido retinoico, requieren del receptor retinoide X como patrón heterodimérico para formar complejos de transcripción activos. En los elementos reguladores, los RN heterodiméricos interactúan  con otro FT unido al ADN para regular la expresión de genes.

El RG es capaz  de remodelar de novo la cromatina. Sin embargo, la mayoría de las interacciones  del RG no son eventos de remodelación de novo sino que la cromatina es preprogramada, es decir, accesible en el estado basal antes de la activación del RG. Esto sugiere que otros factores actúan  para abrir y mantener la cromatina en un estado permisivo. Los FT que actúan sobre la cromatina en células no estimuladas podrían contribuir a determinar el reclutamiento selectivo de RN en los elementos reguladores.  Por lo tanto, la expresión y activación  de FT puede reorganizar dinámicamente  la unión de los RN a los elementos reguladores de una manera  específica de señal.

En conclusión, los RN actúan como sensores dinámicos de  señales externas y median respuestas reguladoras rápidas en la cromatina. La accesibilidad de la cromatina  en los sitios de unión de los RN  es regulada por FT, coactivadores, corepresores y enzimas.  Aunque los sitios pre-existentes de la cromatina abierta  frecuentemente son elementos reguladores  en los cuales son reclutados los RN, la unión inducida  de receptores confiere cambios a la accesibilidad  de la cromatina  mediante la remodelación  de la cromatina subyacente  y los nucleosomas asociados, a través  de la acetilación de residuos específicos de histonas.  Los cambios en la cromatina pueden inevitablemente alterar la ocupación de receptores en enfermedades agudas y crónicas como inflamación, diabetes  y cáncer. En el estado de enfermedad, la activación, el silenciamiento o la sobre expresión  de cofactores de los RN podría promover patrones de accesibilidad de la cromatina alterados o discordantes. Esto, a su vez, podría remodelar la unión del receptor con consecuencias en la transcripción  de genes.

Fuentes: Biddie SC y John S (2014). Conversing with chromatin: the language of nuclear receptors.  Molecular Endocrinology 28: 3-15.

Modulación de la regulación epigenética por ARN no codificantes

La epigenética es conocida  como la regulación de la expresión de genes sin cambios en su secuencia ADN. El  desarrollo reciente de la biología molecular ha incorporado un  nivel de mayor complejidad a los mecanismos epigenéticos clásicos como la metilación de ADN o las modificaciones post-translacionales  de histonas. En este nuevo enfoque, la expresión de genes  puede variar debido a la función de las moléculas  de ARN por sí mismas  o por sus interacciones  con ADN y/o proteínas.  Específicamente, el énfasis apunta hacia la capacidad  de los transcriptos ARN no codificantes (ARNnc) para modular la expresión de genes, es decir, su rol como modificadores epigenéticos. Los patrones de metilación de ADN, una marca epigenética clásica ligada a la expresión de genes, han sido  demostrados en plantas y mamíferos como establemente transmitidos a la descendencia. Sin embargo, el estatus de metilación de ADN no es transmitido  con perfecta fidelidad, provocando diferencias entre los clones de poblaciones celulares.  Asimismo, las modificaciones de las proteínas histonas, mecanismos epigéneticos tradicionales, son dinámicamente editadas por desmetilasas y su distribución puede cambiar en pocas horas en respuesta a estímulos ambientales. Sobre la base de estos datos,  los investigadores han propuesto una expansión  de la definición de epigénetica que incluya las alteraciones  en la cromatina que reflejen ambientes celulares dinámicos y estados de actividad, y la regulación por ARNnc es parte de este cuadro.  Es conocido que durante la fertilización y la implantación del embrión ocurre la desmetilación de ADN  así como su posterior re-metilación,  y que la ADN metiltransferasa 1-3 propaga la metilación CpG después de la fase S a través de las mitosis por asociación  con ADN hemimetilado. La transmisión de las modificaciones de histonas podria involucrar proteínas Polycomb  y seguir un modelo “semi conservador” (similar a la replicación  de ADN) o un patrón aleatorio. En cualquier caso, se requiere de una molécula que reconozca y lleve la metilación paterna a las histonas nuevas.  Las especies ARNnc  están involucradas en la regulación expresión degenes  a través de su influencia  sobre los mecanismos anteriores. Por lo tanto, el rol de los ARNnc en la epigenética parece consistir en reclutar y guiar estos procesos en el momento apropiado  del ciclo celular  a través de la vida deun organismo.

La gran mayoría del genoma humano  es transcripta pero solamente 2%  de estos transcriptos terminan en proteínas. Muchos de los transcriptos restantes  no codifican para proteínas  y fueron registrados inicialmente como artefactos experimentales o “junk”, pero la evidencia demuestra que estas moléculas de ARN pueden ser funcionales.  Más aún, el significado de esta transcripción en la biología de los mamíferos es apoyada por la fuerte correlación entre complejidad del organismo y tamaño del genoma no-codificante mas que por la relación proteína-genoma codificante. Generalmente, los ARNnc de menos de 200 nucleótidos  de longitud son clasificados como cortos y todos los transcriptos más grandes son  registrados como ARNnc largos (lARNnc). Hay varios subtipos entre las especies de ARNnc largos y cortos, muchos de los cuales están involucrados en la regulación de la expresión de genes y pueden ser agrupados de acuerdo con el origen genómico y los procesos biogénicos.

Los lARNn son altamente diversos en estructura y función, por lo que la longitud de la secuencia y la carencia de capacidad codificante quizá sean sus únicas características definitorias. No obstante, han surgido varios patrones que son de interés en el contexto de la regulación epigenómica. Una consideración importante es que mientras la conservación de la secuencia  de loslARNnc es pobre, los transcriptos con posiciones y direcciones correspondientes en referencia a los genes que codifican proteínas son más comunes, lo que indica que sus funciones pueden ser bien conservadas. Frecuentemente, los lARNnc son procesados de manera similar  a los ARNm  y se pueden encontrar en fracciones nucleares o citoplasmáticas. A menudo, los lARNnc son transcriptos  a partir de loci codificantes de proteínas, pero también se han descrito varias subclases de lARNnc con orígenes diferentes. Algunos lARNnc pertenecen a intrones y están compuestos de elementos genómicos transportables. Por otra parte, aunque la existencia de los lARNnc es conocida desde hace varias décadas, la descripción de ARNnc largos intergénicos (liARNnc) es relativamente reciente. Algunas veces,  ambos términos son intercambiables en la literatura, pero rigurosamente el término “liARNnc” se refiere  solamente al subgrupo de lARNnc  que proviene de regiones intergénicas.  Los roles funcionales de los lARNnc pueden agruparse en uno o varios patrones. Por ejemplo, algunos transcriptos son producidos en reacción a perturbaciones en el ambiente celular mientras otros sirven como intermediarios, facilitando el bloqueo de procesos conocidos (incluyendo mecanismos epigenéticos) que involucran ácidos nucleicos y/o proteínas.

Los ARNnc cortos, a diferencia de los lARNnc, se clasifican en base a su origen genómico y a su mecanismo de acción. Muchos de estos subgrupos tienen consecuencias importantes para la expresión de genes, afectando la transcripción y otros procesos. Los microARN (miARN) mejor estudiados son de 20-30 nucleótidos de longitudy usualmentereconocen ARNmpor complementariedad en regiones de 2-7 nucleótidos de la 3`UTR pero también puede ocurrir en la 5`UTR. Esta unión  activa al complejo silente inducido por miARN a través del cual los miARN actúan como represores post-transcripcionales  de la expresión de genes. Este proceso incluye a la endoribonucleasaDicer, la cual está involucrada en la formación de otra clase emergente de ARNnc cortos, los siARN endógenos (endo-siARN). Estos transcriptos  no han sido muy estudiados, pero  se ha visto que a diferencia de los miARN requieren secuencias extensas de complementariedad para inducir la represión de genes. Para producir estos pequeños endo-siARN, la Dicer actúa sobre ARNnc formados  a partir de pares de transcriptos naturales en un locus simple o a partir de pares gen-pseudogen, lo cual puede incluir  transcriptos de distintos cromosomas o a partir de asas que contienen secuencias repetidas.Los ARN que interactúan con PIWI (piARN), otra categoría de ARNnc cortos endógenos, de 26-30 nucleótidos, son independientes  de la Dicer. Los transcriptos precursores de piARN son  clivadosendonucleoliticamenteen el citoplasma. Los piARN pueden silenciar la transcripción  de ARN  a través de apareamiento de bases que conducen a la trimetilación de histona3lisina9 (H3k9mc3, un marcador de cromatina inactiva) por la histona metiltransferasa.

El grupo Polycomb de proteínas fue identificado en D. melanogater por su capacidad  de causar genes silentes heredables. Los complejos Polycomb ocurren en diferentes especies y están compuestos  por subunidades análogas con roles especializados; incluyendo proteínas con dominios de unión a ARN o dominios catalíticos con actividad modificadora de histonas.  Otras subunidades incluyendo los cromodominios  de las proteínas complejo Polycomb represivo 1 (PCR1) se unen a histonas modificadas como la trimetilada histona 3 lisina 27 (H3K27me3). Un ejemplo bien estudiado  de un ARNnc involucrado en el silenciamiento de genes  a través del reclutamiento Policomb es el que tiene lugar  durante la inactivación del cromosoma X, lo cual asegura dosis iguales  de genes ligados a cromosoma X en mamíferos femeninos. El XIST, un lARNnc de 17kb es esencial para este proceso, un ARN del XIST recluta al complejo Polycomb represivo 2 (PCR2) provocando la trimetilción H3K27 en la inactivación del cromosoma X. El PCR1también es reclutado para la inactivación del cromosoma X.

La mayoría de lARNnc que interactúan con complejos Polycomb son ejemplos de transcriptos que operan en cis, es decir que actúan en la misma región en la cual ellos son transcriptos. Otros lARNnc trabajan en trans, utilizan proteínas PcG para modificar la expresión de loci distantes.  Por ejemplo, el HOTAIR, un lARNnctrans activo de 2,2kb transcripto a partir del cromosoma 12, reprime genes en el cromosoma 2 de humanos reclutando los complejos  PRC2 y LSD1, lo cual causa  la trimetilación H3K27 y la pérdida de la activadora H3K4me3. Recientemente, la sobre-expresión de un  ARN trans activo llamado UBC1 fue reportado en muestras de cáncer de vejiga. Este transcripto asociado con al menos dos subunidades PRC2 –EZH2 y SUZ12- está involucrado en la represión  de varios blancos conocidos de ese complejo. La asociación de PCR2 con cromatina activa también ha sido reportada. Específicamente, la subunidad EZH1 del PCR2 de mamíferos puede unirse a dominios activos  y promover la elongación transcripcional durante el desarrollo de los miocitos.

Los lARNnc , además de la interacción con proteínas PcG, también regulan la expresión de genes a través de interacciones  con otras enzimas epigenéticas. En efecto, Fendrr, un lARNnc involucrado  el desarrollo cardiaco, regula genes individuales  específicamente a través de la unión y/o modulación  al promotor de PRC2 y H3K4 metiltransferasa. En contraste con los lARNnc que funcionan exclusivamente  a través de mecanismos PRC2, otros transcriptos actúan incrementando la expresión  de genes. Los lARNnc también han sido implicados  en el silenciamiento de genes  a través de la metilación  del ADN. La dinámica de las modificaciones  de histonas y ADN sugiere un mecanismo para su remoción. Mientras la desacetilación de histonas y la desfosforilación  y desmetilación de ADN han sido reconocidos desde hace algún tiempo, la idea de desmetilación de histonas había sido controversial  hasta el descubrimiento de la amino oxidasa nuclear LSD1. Esta enzima cuando es anclada al gen por el lARNnc HOTAIR causa la represión del gen a través de la remoción de H3K4me3.  Sin embargo, otras especies de desmetilasas potencialmente pueden activar la expresión a través de  histonas metiladas.

Los ARNnc cortos tienen muchas interacciones con las rutas epigenéticas tradicionales  y la modulación de estos transcriptos puede tener importantes consecuencias. Los ARNnc cortos controlan la expresión de genes principalmente afectando la transcripción o la estabilidad delARNm. Adicionalmente, estos ARN cortos interactúan  con el PRC2 estabilizando el complejo cerca del sitio de transcripción,  provocando la represión de la cromatina en cis.  Más aún, los miARN son conocidos reguladores de la expresión de varios componentes  delos complejosPolycomb. Al menos dos miARN que son regulados negativamente por oncogenes involucrados en la tumorigénesis, incrementan la expresión de la histona metiltransferasa EZH2. Otros miARN actúan  como supresores tumorales  a través de la inhibición de la “stemcell” Bmil, la cual es también componente del PRC1.  En cambio, el miARN-214 reduce la expresión de EZH2 y promueve la diferenciación de músculo esquelético. La ruta ARNi es crucial para la formación  de heterocromatina y su propagación a través de las divisiones celulares. Esto sugiere un mecanismo para los cambios en la expresión de genes inducidos por endo-siARN.

Las histonas desacetilasas (HDAC), como proteínas PcG, están involucradas en el silenciamiento de genes   a través de la remoción  de marcas activadoras más que por la deposición de modificaciones represivas. Algunas HDAC han sido implicadas en enfermedades, la sobre-expresión de HDAC1, por ejemplo,  ha sido observada en ciertos tipos de cánceres. Sin embargo, en el carcinoma hepatocelular, la sobre-expresión de HDAC1-3 ha sido asociada con disminución dela proliferación y formación  del tumor.

Los miARN regulan negativamente la metilación de ADN, lo cual frecuentemente resulta en un incremento de la expresión de genes. Por ejemplo, en células de cáncer de pulmón y leucemia, la expresión de miARN disminuye la tumorigenicidadin vitro e in vivo. Los endo-siARN también pueden estar involucrados en la metilación de ADN. En este caso, el proceso ocurre en dos etapas, el reclutamiento inicial de siARN y luego la metilación de ADN cis o trans.

Además de influir en la expresión y función de enzimas epigenéticas, muchos ARNnc son blancos de estos mismos procesos. Esto, a diferencia de otros genes regulados epigenéticamente, a menudo tiene el efecto de regular negativamente cambios en la expresión degenes. Este concepto está bien ilustrado  en la biología normal y en las perturbaciones que ocurren en las enfermedades. Por ejemplo, la hipermetilación y la disminución  de la expresión  de un grupo de miARN están asociadas con cáncer de mama en humanos. También, varios miARN (incluyendo al miARN128a) son más altamente expresados en el cerebelo de adultos que en el de niños y son regulados negativamente en el meduloblastoma, un tumor del cerebelo. El miARN128a inhibe al Mmi-1, un miembro del complejo PRC1, y promueve la disminución  de la proliferación de células de meduloblastoma. Entonces, el programa de desarrollo normal involucra la expresión dinámica de este miARN, mientras que la reversión a un estado de desarrollo temprano está asociada con cáncer. La perdida de represión post-transcripcional de un miARN resulta en un incremento de la acción del complejo PRC1, causando cambios en el estado de la cromatina. Los miARN no son los únicos ARN cortos involucrados en la patogenia de las enfermedades a través de rutas epigenéticas, los endo-siARN también pueden causar cambios en la expresión de genes  ambientalmente sensibles en los tejidos somáticos.

En conclusión, la regulación epigenética de la expresión de genes es un concepto que explica la contribución del ambiente en la biología de un organismo. Sin embargo, la definición contemporánea de epigenéticatambién incluye al silenciamiento de genes o la regulación positiva causadas por ARNnc, lo cual ocurre en la biología normal bajo la influencia de complejos epigenéticos. Esta amplia definición incorpora las influencias ambientales causantes de enfermedades que pasan a través de divisiones celulares, como se ha visto en el cáncer. También cubre las discrepancias críticas en la expresión de genes observadas entre células con secuencias idénticas de ADN, durante la diferenciación, o entre tejidos en desarrollo. La regulación  dinámica, ambientalmente sensible, de la expresión de genes por ARNnc largos y cortos ocurre a través  de la interacción directa e indirecta  con los mecanismos epigéneticos clásicos, formando una extensa red epigenética.  Los ARNnc son conocidos por su capacidad de  unirse a -y reclutar- complejos que modifican histonas  o por remover grupos metilos y acetilos. Estos transcriptos también modulan ADN metiltransferasas, facilitando o suprimiendo la metilación del ADN. Los loci que son blanco  de cada uno de estos mecanismos pueden codificar proteínas y codificar o no codificar  transcriptos ARN. Los ARNnc a su vez pueden afectar la expresión de genes interactuando  con ARNm o a través de mecanismos de retroalimentación.  Estos hallazgos pueden contribuir  a la versión modificada  del “dogma central”  de Francis Crick en el cual el ARN no sólo es una parada en la ruta entre ADN y proteína, sino que también proporciona importante retroalimentación reguladora para la transcripción y la translación. Por lo tanto, además del rol de los ARNnc en la epigenética clásica, estos transcriptos pueden servir como intermediarios epigenéticos transmitiendo el mensaje  a través de una amplia red de regulación dinámica de la expresión de genes.

Fuente: Peschansky VJ y Wahlestedt C (2014). Non-coding RNAs as direct and indirect modulators of epigenetic regulation. Epigenetics 9(1): 3-12.

Metabolómica de la diabetes tipo 2

La investigación metabólica ha tenido un gran avance con el uso de técnicas  de química analítica para definir fenotipos metabólicos asociados con determinadas patologías. Estas técnicas facilitan el análisis de diferentes sustancias  que en conjunto forman el complemento metabólico  de un organismo. El desarrollo y la adaptación  de este enfoque ha dado lugar al campo de la metabolómica (también conocida como metabonómica). La metabolómica ayuda a medir los metabolitos (moléculas pequeñas) presentes en una célula, un tejido o un organismo, durante alteraciones genéticas o estímulos fisiológicos, mediante el uso de técnicas de química analítica.  El metabolomo es el producto terminal del genoma y consiste en el complemento total de todos los metabolitos que un espécimen biológico necesita para crecer y mantener su función normal en un estado fisiológico específico. Las estrategias metabolómicas se dividen en dos grupos: sin  blanco definido y con blanco definido. La primera, consiste  en el análisis  de todos los componentes medibles en una muestra incluyendo compuestos desconocidos. La segunda,  consiste en la medición  de grupos definidos  de metabolitos caracterizados químicamente. Las dos técnicas analíticas más usadas  en la metabolómica son la espectrometría de masa y la espectroscopia  por resonancia magnética nuclear (NMR).  La espectrometría  de masa es un método más sensible que la NMR.  Las técnicas metabolómicas han permitido identificar biomarcadores de diferentes enfermedades humanas, como la diabetes tipo 2. El interés en el uso de la metabolómica como método  para descubrir biomarcadores de la diabetes obedece, en aparte, a la etiología metabólica de la enfermedad. Por lo tanto, se espera que un método que se basa en la medición  de metabolitos resulte  más efectivo para definir los cambios asociados  con una enfermedad metabólica como la diabetes tipo 2.   

La Administración de Alimentos y Drogas (FDA) de los Estados Unidos define un biomarcador como “una característica  que es objetivamente medida y evaluada como indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos o respuestas farmacológicas a una intervención  terapéutica”. Clínicamente, los biomarcadores son usados para monitorear el progreso de una enfermedad o para medir los efectos de un tratamiento específico.  En el caso de la diabetes, la necesidad  de nuevos biomarcadores es relativamente reciente porque el incremento de la glucosuria ha sido utilizado como un marcador confiable y también porque la deficiencia de producción o acción de la insulina rápidamente se manifiesta como hiperglucemia, otro marcador bastante confiable.  Sin embargo, una vez que la enfermedad se hace presente, los predictores clínicos actuales (glucosa e insulina en ayunas, índice de masa corporal), aunque útiles para determinar riesgos en la diabetes, son de poca ayuda para el entendimiento  patológico de la enfermedad.  A pesar de los sustanciales avances en la genética de la enfermedad, con la identificación  de aproximadamente 20 “loci” que contribuyen al riesgo  de diabetes, estos “loci” tienen pequeños efectos  y representan sólo 5-10% del componente hereditario  de la enfermedad. El limitado rol de la herencia  refleja en parte que en la mayoría de personas, la resistencia a la insulina deriva de la interacción de la predisposición genética con factores ambientales como dieta, contaminación, estilo de vida y reducción de ejercicio físico.  Más aún, la restauración del metabolismo normal de la glucosa en los individuos pre-diabéticos con resistencia a la insulina a través del uso de dieta, ejercicio o intervención farmacológica, puede retardar o prevenir el progreso de la diabetes tipo 2. Por lo tanto, hay una necesidad clínica real de identificar marcadores de resistencia a la insulina y diabetes capaces de predecir la enfermedad antes del establecimiento de los síntomas. En este contexto, la metabolómica ha hecho importantes contribuciones  para identificar biomarcadores asociados con la resistencia a la insulina y con el riesgo de desarrollar diabetes tipo 2.

La característica definitiva de la diabetes tipo 2 es la alteración de la homeostasis glucosa-insulina, generalmente con la obesidad de fondo.  Los metabolismos de la glucosa y los lípidos frecuentemente son parte  de estudios clínicos y está bien establecida la asociación entre aminoácidos circulantes y concentraciones de insulina, con varios aminoácidos que muestran  un efecto insulinotrópico.  Las concentraciones aumentadas de leucina, isoleucina y glicerol constituyen los más fuertes predictores metabólicos de la baja sensibilidad a la insulina. Por lo tanto, estos aminoácidos  de cadena ramificada (BCAA)  pueden ser utilizados para monitorear el desarrollo de la resistencia a la insulina. Las concentraciones circulantes aumentadas de los BCAA permiten  diferenciar los perfiles metabólicos de pacientes obesos  de los de  individuos delgados y pueden estar involucradas  en el inicio de la resistencia a la insulina.  Las ratas alimentadas con dietas ricas en grasa suplementadas con BCAA ganan peso y desarrollan resistencia a la insulina mientras que las ratas con dietas ricas en grasas sin BCAA no desarrollan resistencia a la insulina. En un estudio metabolómico con 40 pacientes diabéticos y 60 controles  seleccionados aleatoriamente, los BCAA  resultaron asociados con diabetes.  Los estudios metabolómicos también han identificado asociaciones entre resistencia a la insulina y otras clases de  aminoácidos  y sus intermediarios metabólicos. Por ejemplo, el glutamato se correlaciona fuertemente con resistencia a la insulina y un incremento de la relación glutamina/glutamato predice un riesgo reducido de inicio de diabetes en humanos. Esta asociación también ha sido explorada en ratones y se ha demostrado que la suplementación de glutamina durante ocho semanas mejora la tolerancia a la glucosa y que las concentraciones circulantes de glutamina se correlacionaron inversamente con las de  BCAA.  La naturaleza de esta asociación no está clara pero se especula  que la glutamina  podría aumentar la liberación de péptido glucagonoide 1 (GLP-1), el tráfico  del transportador de glucosa GLUT 4, la secreción de insulina o la sensibilidad del tejido adiposo a la insulina. Las asociaciones reciprocas de glutamina y glutamato con la diabetes podrían también  reflejar el rol del glutamato como intermediario del ciclo de ácidos  tricarboxilico: a través de la  conversión en α-cetoglutarato, las altas concentraciones  de glutamato podrían  proporcionar una fuente alterna de energía a la utilización de glucosa vía glucolisis o de ácidos grasos  vía β-oxidación. Los hidroxiácidos formados, en parte, durante el metabolismo de los aminoácidos también han sido asociados con la resistencia a la insulina. En este sentido, la concentración aumentada de α-hidroxibutirato es considerada el metabolito más discriminatorio  en términos de resistencia  a la insulina. Los investigadores sugieren que el α-hidroxibutirato puede ser un predictor positivo de pobre control glucémico  o diabetes. Aparentemente, el α-hidroxibutirato inhibe la secreción de insulina inducida por la glucosa. Por otra parte, varias investigaciones metabolómicas  han registrado una asociación inversa entre glicina y diabetes u obesidad y sugieren que la resistencia a la insulina podría resultar en la expresión aumentada de  la síntetasa de ácido δ-aminolevulínico y por consiguiente en la producción de ácido 5-aminolevulínico a partir de glicina o que el estrés oxidativo asociado con diabetes produce un incremento de la demanda  de glutation  y la depleción de la glicina circulante.

Los estudios metabolómicos pueden también proporcionar marcadores de la efectividad de las intervenciones clínicas  para mejorar el fenotipo metabólico de los pacientes. Por ejemplo, el bypass gástrico es considerado un tratamiento efectivo para pacientes severamente obesos porque induce pérdida de peso y una de las principales características de esta intervención es la rápida mejoría de la sensibilidad a la insulina. El análisis metabolómico ha sido usado para investigar las pronunciadas alteraciones metabólicas que ocurren después de la cirugía y especialmente para investigar cómo la restauración  de la sensibilidad a la insulina  afecta el metabolismo de los BCAA. En uno de esos estudios, la pérdida de peso después del bypass gástrico fue asociada  con disminución de las concentraciones circulantes de BCAA.

A partir de los estudios metabolómicos han surgido varias explicaciones para el incremento de BCAA circulantes  en personas obesas e individuos con pre-diabetes, entre ellas, la expresión alterada  de los genes en las rutas catabólicas de los BCAA. Una teoría reciente, apoyada por numerosos estudios, involucra al metabolismo de los BCAA en el tejido adiposo. Modestas perturbaciones  de las enzimas catabólicas  pueden afectar sustancialmente las concentraciones circulantes de BCAA. El catabolismo de los BCAA en el tejido adiposo está inhibido en modelos animales de obesidad y aumentado en la grasa subcutánea  de pacientes después de  cirugía bariátrica y pérdida de peso. Más aún, la sensibilidad a la insulina se correlaciona altamente con la expresión de genes catabólicos de los BCAA en el tejido adiposo blanco  de pacientes, una asociación que también ha sido notada en modelos animales de diabetes. Estos hallazgos sugieren  que la disminución del catabolismo de BCAA en el tejido adiposo resistente a la insulina influye en las concentraciones circulantes de metabolitos de BCAA. Los BCAA también pueden contribuir directamente a la resistencia a la insulina.  Estudios recientes reportan que los BCAA de la dieta pueden inducir resistencia a la insulina  a través de un mecanismo que involucra al eje mTOR-JUN-IRS-1en músculo esquelético.  La insulina también tiene un efecto directo sobre el metabolismo de los BCAA en músculo esquelético, disminuyendo la oxidación de los BCAA a través de la regulación  de las enzimas catabólicas BCAA aminotransferasa y deshidrogenasa de cetoácidos  de cadena ramificada. Sin embargo, para algunos investigadores, no son las concentraciones de BCAA las que contribuyen a la diabetes sino las concentraciones de los productos de la degradación de BCAA, es decir α-cetoácidos. El incremento del catabolismo de BCAA en el musculo esquelético resulta de la disminución de la sensibilidad a la insulina, y el incremento de la disponibilidad de sustratos puede contribuir  a la resistencia a la insulina. Algunos investigadores han propuesto  que la función de los BCAA en un medio hiperlipémico contribuye al desarrollo de resistencia a la insulina. En este contexto, las concentraciones aumentadas  de BCAA   sobrecargan las rutas catabólicas  en hígado y músculo esquelético, aumentando la producción de los catabolitos   succinil-CoA  y propionil–CoA reduciendo la β-oxidación de ácido grasos y el catabolismo de la glucosa.    La pérdida de eficiencia  en las rutas  oxidativas centrales amplifica la oxidación  de productos parcialmente oxidados, incrementa el estrés mitocondrial, reduce la sensibilidad a la insulina y altera la regulación  de las concentraciones circulantes de glucosa.

La composición de ácidos grasos  del plasma, fosfolípidos, esteres de colesterol, triglicéridos y los ácidos grasos  de los eritrocitos han sido usados como biomarcadores  para estudiar  la relación entre ingesta  de grasa y desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes. La cromatografía de gas ha sido utilizada en estudios epidemiológicos a gran escala  para investigar si ácidos grasos específicos y -potencialmente- dietas específicas se correlacionan  con el riesgo  de desarrollar resistencia a la insulina y diabetes. En algunos estudios metabolómicos, se han identificado asociaciones entre concentraciones aumentadas de  ácido palmitoleico con triglicéridos aumentados y resistencia a la insulina. Sin embargo, esta asociación  podría reflejar un incremento  de la lipogénesis de novo en el hígado causada por ingesta de carbohidratos en la dieta más que un efecto directo  de la ingesta de palmitoleato a través de la dieta. Varios estudios reportan que el ácido graso saturado palmitato reduce la eficiencia  de la señal insulina. Sin embargo, el palmitato es también el producto directo de la lipogénesis  de novo a partir de glucosa y este proceso se encuentra aumentado en modelos animales de diabetes.  Por lo tanto, el incremento de la lipogénesis de novo durante la diabetes podría ser reflejado por especies de lípidos presentes  en la circulación. Otros estudios reportan una asociación inversa entre la concentración de ácidos grasos n3-poliinsaturados y el riesgo de  desarrollar diabetes. Además de las concentraciones de ácidos grasos individuales, la  relación entre ácidos grasos específicos también puede reflejar  procesos fisiológicos específicos y por consiguiente proporcionar  un enlace entre enfermedad y perturbaciones  en rutas metabólicas particulares. Por ejemplo, la relación palmitato/linoleato en la fracción triglicéridos de las VLDL –referida como índice lipogénico-  refleja la cantidad de lipogénesis de novo. Las relaciones de otros ácidos grasos  son usadas para  estimar la actividad desaturasa y también para investigar resistencia a la insulina. En un estudio reciente, después de hacer ajustes por índice de masa corporal, edad, sexo, glucosa e insulina en ayunas, triglicéridos totales y HDL colesterol, diez lípidos fueron asociados con riesgo aumentado  de diabetes y cinco especies de lípidos fueron  asociadas inversamente con el riego de desarrollar diabetes. El marcador positivo más significativo para diabetes fue el triacilglicérido 50:0 y el marcador negativo más significativo fue el triacilglicérido 58:10.

En resumen, la metabolómica tiene el potencial para definir nuevos marcadores  de resistencia a la insulina y prediabetes.  Con respecto a los metabolitos individuales, los BCAA son los marcadores más promisorios  de resistencia a la insulina y prediabetes. Las alteraciones en el metabolismo de  los BCAA han sido registradas en modelos animales, individuos obesos  y en pacientes después de cirugía bariátrica. Los resultados de los estudios en grandes poblaciones demuestran  que los BCAA son predictivos de diabetes de una manera aditiva a los modelos clínicos establecidos. Lípidos específicos también son potenciales marcadores de resistencia a la insulina. Los ácidos grasos palmitato, palmitoleato y oleato han sido asociados con resistencia a la insulina en humanos y animales. Un punto clave es entender  cuanto de la dieta contribuye a las concentraciones elevadas de ácidos grasos, en comparación con la lipogénesis de novo, a partir del consumo de carbohidratos. La incorporación de hallazgos del genoma a lo estudios metabolómicos ha aumentado el entendimiento del rol de los metabolitos  en la patogenia de la enfermedad. La triangulación  de datos genéticos, metabolómicos y fenotípicos podría ser una técnica poderosa para determinar  la contribución de los metabolitos a la enfermedad.

Fuente: Roberts LD et al (2014). Towards metabolic biomarkers of insulin resistance and type 2 diabetes: progress from the metabolome.  Lancet Diabetes Endocrinology 2: 65-75.