El lenguaje de los receptores nucleares

El ADN del genoma de los eucariotes -y las histonas- forman estructuras de orden superior  de la cromatina, con el nucleosoma como unidad básica de aproximadamente 146 bp de ADN  alrededor de  un octámero  de histona. La cromatina es un importante regulador  de diversos procesos biológicos como la replicación del ADN, la reparación del ADN, la división celular y la transcripción. La estructura de la cromatina puede ser modificada  a través de muchos mecanismos, incluyendo modificaciones químicas del ADN o las histonas, sustitución  de histonas clásicas por variantes de histonas en el nucleosoma y  reposición de nucleosomas.  Entre los factores que se unen al ADN, como factores de transcripción (activadores o represores), se encuentran los receptores nucleares (RN) que actúan como sensores moleculares de estímulos fisiológicos y ambientales. En respuesta a diversas señales –esteroides, intermediarios metabólicos y toxinas químicas-  los RN  regulan rutas metabólicas, reproductivas y circadianas o contribuyen a estados patológicos como inflamación, obesidad y cáncer.  Hasta el presente, la familia de RN comprende 48 miembros en humanos, los cuales median la transcripción de genes  a través  de distintos mecanismos, incluyendo las clásicas actividades de transactivación y transrepresión.  Clásicamente, los RN se unen a secuencias específicas  de ADN y reclutan cofactores que modifican la estructura de la cromatina, la cual a su vez modula el reclutamiento y la actividad  de la ARN polimerasa para reprimir o aumentar la transcripción.  Sin embargo, los RN también pueden modular diferentes rutas  de una manera no genómica y su actividad puede ser influenciada por modificaciones post-translacionales (acetilación, fosforilación, sumoilación y ubiquitinación), lo cual los convierte en blancos de otras rutas celulares. 

A pesar del amplio rango de actividades, los RN tienen una estructura organizacional común que consiste en un dominio N-terminal regulador, el cual contiene la función  activación independiente  de ligando 1 (AF1) que usualmente tiene actividad transcripcional muy débil (con la notable excepción del RA), pero es capaz  de actuar sinérgicamente  con otro dominio de activación, función activación  2 (AF2), presente en el dominio de unión con el ligando (LBD). El dominio más conservado es el dominio de unión al ADN (DBD), el cual contiene  el P-box, responsable  de la interacción directa con el ADN y la especificidad de unión al ADN. El DBD tiene dos dedos de cinc que reconocen los elementos de respuesta  específicos del NR en las regiones reguladoras de sus genes blanco.  Los RN pueden unirse a los elementos de respuesta  localizados  en la proximidad de los promotores de los genes blanco y a elementos más distales, como monómeros, homodímeros (RG, RE y RA) o heterodímeros con el receptor retinoide X (RXR).  Los elementos de respuesta específicos  tienen dos “core” hexaméricos separados por un número variable de nucleótidos. El DBD también tiene una interface de dimerización  que puede ser el sitio de modificaciones post-translacionales que resultan en efectos diferentes para los diferentes RN. En algunos RN, la fosforilación del DBD resulta en disminución  de la unión al ADN (TRH, RE); en otros incrementa la unión al ADN y el reclutamiento de co-activadores. El DBD y el LBD C-terminal  están conectados por un dominio flexible  llamado región bisagra. EL LBD presenta una estructura hidrofóbica para el reconocimiento del ligando,  también contiene el dominio AF2, cuya acción depende de la presencia  del ligando unido así como sitios  responsables de la dimerización y regiones de unión de co-rereguladores.  

Para la mayoría de RN, la unión del ligando es el evento crítico que cambia su estado inactivo por un estado activo mediante la inducción de un cambio conformacional en el LBD. La conformación activa  permite la segunda etapa de la activación del RN; el reclutamiento de complejos co-reguladores. Muchos de estos cofactores funcionan como factores remodeladores  de la cromatina y catalizan las modificaciones de las histonas. Pequeñas modificaciones  de la estructura del ligando afectan la interface  de unión del co-activador, proporcionando una base molecular  para la especificidad y potencia  de la unión del ligando al RN. El LBD  es también un blanco  para modificaciones post-translacionales, las cuales gobiernan  una variedad  de funciones celulares, incluyendo la actividad del RN, la afinidad de unión al ADN, la sensibilidad del ligando, la estabilidad  y  distribución subcelular del receptor. Por lo tanto, las modificaciones post-translacionales  del RN pueden en última instancia resultar  en incremento o  disminución de la expresión  del gen blanco o en la transrepresión  de otras rutas.

Sobre la base de las propiedades de unión de los ligandos, los RN se pueden dividir en tres clases: RN hormonales, RN metabólicos y RN “orfan”. Los RN hormonales  a menudo se localizan en el citosol. Una vez que se unen a su ligando, ellos son translocados  al núcleo, usualmente como homodímeros, y se unen a los elementos de respuesta de RN. Los miembros de esta subfamilia incluyen al receptor de andrógenos (RA), estrógenos (RE), glucocorticoides (RG) y  progesterona (RP) y los ligandos incluyen hormonas lipídicas. Algunos RN hormonales como el ER y el GR forman complejos ligando-receptor que se unen al ADN en sitios reguladores del gen blanco. Otros RN (ER y PR) se unen a la cromatina y atraen factores coactivadores que tienen propiedades remodeladoras de la cromatina.  La unión al ADN y la remodelación de la cromatina aumentan el reclutamiento y/o función  de la maquinaria general de transcripción.  Los receptores metabólicos se localizan típicamente en el núcleo, se unen al ADN principalmente como heterodímeros  con el receptor retinoide X (RXR). En ausencia de ligando, ellos a menudo forman complejos en la cromatina con proteínas co-represoras. En este caso, los ligandos que se unen  al RN causan la disolución  del co-represor y reclutan proteínas co-activadoras.  Proteínas adicionales de la maquinaria basal de transcripción, incluyendo la ARN polimerasa II, son reclutadas por el complejo RN-ADN para iniciar el proceso de transcripción.  Los miembros de esta subfamilia incluyen  FXR, LXR, PPAR y otros, y entre los ligandos de este subgrupo  están  los lípidos de la dieta. El tercer subgrupo de RN  es la familia de receptores “orfan”, cuyos ligandos reguladores son aún desconocidos, incluso pueden no existir o bien  son candidatos que  recientemente  han sido identificados (orfan adoptados). Los miembros de este subgrupo incluyen los factores de transcripción  de la ovoalbúmina de pollo, el ERBA-α/β, el homologo de receptor hepático-1 (LRH1) y otros.

Los cromosomas están organizados como un estado de condensación continuo y los estados de compactación de la cromatina modulan la accesibilidad de los factores de transcripción (FT) al ADN subyacente. Generalmente, la heterocromatina condensada restringe la transcripción de genes, suprime la recombinación cromosomal y estabiliza centrómeros y  telómeros.  Por el contrario, la eucromatina es relativamente descondensada y rica en regiones que codifican genes y elementos transcriptos activamente. Entre los dominios eucromáticos y heterocromáticos  existen regiones discretas de cromatina altamente descondensada asociada con elementos reguladores activos (promotores, aumentadores, silenciadores, etc). Las histonas nucleosomales, H2A, H2B, H3 y H4, experimentan modificaciones post-translacionales de residuos en el extremo N-terminal, principalmente. Estas modificaciones (acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación), programan señales de  activación o  silenciamiento dependiendo de la modificación química específica y del residuo de la histona. Por ejemplo, la acetilación de histonas generalmente está asociada  con elementos reguladores activos e incluye la modificación de lisinas especialmente en las colas de H3 y H4. Por otra parte, La metilación de histonas está asociada con  activación y represión, dependiendo  del residuo modificado y el número de grupos metilos incorporados. Por ejemplo, la mono, di y trimetilación  de la lisina 4  de la H3 están asociadas con promotores activos.

Los RN de los esteroides  son expresados selectivamente  en distintos tipos de tejidos y regulan genes de una manera altamente específica. Estos receptores tienen el potencial para interactuar con cientos o miles  de sitios en el genoma de los mamíferos. Sin embargo, los experimentos de inmunoprecipitación  de cromatina  han demostrado que los receptores de los esteroides tienen un perfil de unión muy restringido, y una gran cantidad de secuencias de unión en el ADN permanece desocupada.  Por otra parte, por mucho tiempo se ha aceptado que la activación del RG induce la remodelación de novo de la cromatina, pero estudios recientes sugieren que esa no es la característica predominante de la activación de los RG. De acuerdo con esos estudios, la mayoría de eventos  de la unión de GR ocurren en elementos reguladores pre-existentes en el estado basal. Entonces, hay dos distintas clases de interacciones de los GR con la cromatina: el primer –y predominante-mecanismo involucra la unión en regiones accesibles de la cromatina en el estado no estimulado de la célula, mientras que la segunda clase de interacción   es mediada  vía mecanismo clásico de remodelación de cromatina dependiente  de receptor.  En células de mamíferos, más de 70% de la unión de GR está asociado con cromatina abierta pre-existente y aproximadamente 20% de la unión  de GR ocurre en cromatina cuya remodelación es inducida por hormona. Estas clases de interacción FT-cromatina han sido validadas con otros RN.  El establecimiento de cromatina abierta  en el estado no estimulado está determinado  por la presencia de complejos multiproteicos que incluyen FT, cofactores y complejos remodeladores de cromatina que colectivamente modifican la accesibilidad  de la cromatina.

Los coactivadores  asociados a un RN tienen importantes roles biológicos y actúan como potentes reguladores  de la respuesta al estrés metabólico y hormonal. El reclutamiento de acetiltransferas, como la p300, por un RN a través  interacciones proteína-proteína directas representa un mecanismo general de inducción de expresión de genes. Estas actividades enzimáticas acetilan histonas en elementos reguladores y promotores de los genes blanco tanto de manera dependiente de hormona como independiente de hormona.  Aunque un RN puede tener cientos de genes blanco y unirse a miles  de elementos reguladores, el uso de un coactivador único no es universal. Por ejemplo, en la ruta de señalización  del RA solo 50%  de los genes regulados por andrógenos dependen de la acetiltransferasa p300. Además de las acetiltransferas, los RN interactúan  con  -y reclutan-    metiltransferasas de histonas. Los mecanismos que gobiernan  el reclutamiento selectivo y la acción de los activadores no están muy claros. La fosforilación  del RN modifica las interacciones  con los cofactores y restringe el reclutamiento de coactivadores. La presencia de distintas modificaciones de las histonas también podría proporcionar señales para reclutamientos específicos  de los RN. La secuencia de ADN de los elementos reguladores individuales también interviene en el reclutamiento específico  de cofactores. 

El reclutamiento de corepresores es un mecanismo primario mediante el cual los RN median la represión transcripcional. Diversas proteínas corepresoras  interactúan con los Rn, incluyendo desacetilasas de histonas. El RG recluta complejos corepresores  en  secuencias de ADN asociadas  con regulación negativa y en sitios de transrepresión, donde el RG actúa de una manera independiente  de ADN reclutando desacetilasas  de histonas. Algunos RN en su estado basal sin ligando estabilizan complejos corepresores en la cromatina para silenciar  genes blanco. La metilación del ADN es un mecanismo epigenético para silenciar genes.  La acción del RN en la desmetilación de ADN no está muy claro. Sin embargo, la unión de receptores a los elementos reguladores en la cromatina abierta  coincide con ADN hipometilado. La evidencia reciente ha demostrado que los RN pueden regular dinámicamente  el estado de metilación  de ADN.

Los remodeladores de cromatina modifican los contactos  nucleosoma-ADN y son reclutados por los RN. Los mecanismos a través de los cuales los remodeladores de cromatina interactúan con los nucleosomas  no son muy claros actualmente. Los modelos propuestos sugieren que los remodeladores de cromatina interactúan directamente con los nucleosomas   través de residuos de histonas modificados. Alternativamente, los FT, como RG y RE, pueden reclutar activamente  remodeladores  de una manera condicional. En la inducción y represión  mediadas por RN, los remodeladores de cromatina pueden  actuar para mantener accesible la cromatina por factores de unión al ADN inducibles, por lo que  la activación o represión  de la transcripción  es mediada a través del   reclutamiento  de cofactores activadores   o represores.  Todos estos modelos implican un rol crítico para los complejos remodeladores de cromatina en la unión  del RN al ADN. La perdida de la actividad  remodeladora de la cromatina  por inactivación mutacional  en cánceres reorganiza  la unión  de RN,  con el resultado  de silenciamiento o activación   de genes relacionados con enfermedad.

Los RN como factores inducible por estímulo interactúan directa o indirectamente con FT inducibles –o unidos constitutivamente- en los elementos reguladores. Estas interacciones regulan la estructura de la cromatina local y modulan las respuestas transcripcionales. Las interacciones entre FT son un principio general de las redes reguladoras y representan una propiedad general de la cromatina en las células eucariotas.  Los receptores  de hormonas esteroides (RG, RA, RE) pueden homodimerizarse, unirse a los elementos de respuesta e interactuar con FT para modular la transcripción de genes a través de interacciones aditivas, sinérgicas o antagónicas.  Alternativamente, estos receptores pueden unirse  como monómeros e interactuar indirectamente  con FT unidos a los elementos reguladores. Otros RN, como el receptor hepático X y el receptor de ácido retinoico, requieren del receptor retinoide X como patrón heterodimérico para formar complejos de transcripción activos. En los elementos reguladores, los RN heterodiméricos interactúan  con otro FT unido al ADN para regular la expresión de genes.

El RG es capaz  de remodelar de novo la cromatina. Sin embargo, la mayoría de las interacciones  del RG no son eventos de remodelación de novo sino que la cromatina es preprogramada, es decir, accesible en el estado basal antes de la activación del RG. Esto sugiere que otros factores actúan  para abrir y mantener la cromatina en un estado permisivo. Los FT que actúan sobre la cromatina en células no estimuladas podrían contribuir a determinar el reclutamiento selectivo de RN en los elementos reguladores.  Por lo tanto, la expresión y activación  de FT puede reorganizar dinámicamente  la unión de los RN a los elementos reguladores de una manera  específica de señal.

En conclusión, los RN actúan como sensores dinámicos de  señales externas y median respuestas reguladoras rápidas en la cromatina. La accesibilidad de la cromatina  en los sitios de unión de los RN  es regulada por FT, coactivadores, corepresores y enzimas.  Aunque los sitios pre-existentes de la cromatina abierta  frecuentemente son elementos reguladores  en los cuales son reclutados los RN, la unión inducida  de receptores confiere cambios a la accesibilidad  de la cromatina  mediante la remodelación  de la cromatina subyacente  y los nucleosomas asociados, a través  de la acetilación de residuos específicos de histonas.  Los cambios en la cromatina pueden inevitablemente alterar la ocupación de receptores en enfermedades agudas y crónicas como inflamación, diabetes  y cáncer. En el estado de enfermedad, la activación, el silenciamiento o la sobre expresión  de cofactores de los RN podría promover patrones de accesibilidad de la cromatina alterados o discordantes. Esto, a su vez, podría remodelar la unión del receptor con consecuencias en la transcripción  de genes.

Fuentes: Biddie SC y John S (2014). Conversing with chromatin: the language of nuclear receptors.  Molecular Endocrinology 28: 3-15.