El hemo y la activación de la señal TLR4

Los receptores similares a Toll (TLR) reconocen patógenos invasores y son sensores y reguladores esenciales del sistema inmune innato. Las infecciones por bacterias, hongos y virus activan varios TLR que juegan un rol en la defensa del huésped pero también pueden causar sepsis y daño tisular. La estimulación de los TLR por sus respectivos ligandos específicos inicia cascadas de señalización que median la activación de factores de transcripción y la secreción de moléculas pro-inflamatorias. Por ejemplo, el TLR4 es  estimulado por los componentes de la pared bacteriana, lipopolisacáridos (LPS), también conocidos como endotoxinas, los cuales típicamente  son  pro-inflamatorios.  Recientemente, se han descritos otros compuestos que interactúan con –y estimulan- el TLR4, incluyendo ácido hialurónico,   la proteína Der p2, el níquel y varias moléculas endógenas liberadas por las células dañadas, los cuales colectivamente son llamados  patrones moleculares  asociados al peligro (DAMP). En particular, el hemo derivado de las células rojas sanguíneas ha sido implicado en la señal TLR4 y ha sido propuesto como un DAMP que afecta la respuesta inflamatoria en una variedad de condiciones fisiopatológicas.

   El hemo es un tetrapirrol que contiene hierro con funciones importantes en varios procesos biológicos como grupo prostético de hemoproteínas tanto en su forma de unión covalente como no covalente. Por ejemplo, en la hemoglobina y la mioglobina, el hemo es usado para transporte y almacenamiento de oxígeno, mientras en los citocromos está involucrado en el transporte de electrones y la generación de energía. El hemo también es importante para enzimas como ciclooxigenasa-2, sintetasa de óxido nítrico-1, NADPH oxidasa,  catalasa y peroxidasa. Por el contrario, el hemo no unido a proteína, también llamado hemo “libre”, puede ser peligroso y causar efectos pro-oxidantes, pro-inflamatorios y citotóxicos.  Adicionalmente, el hemo  puede mediar el reclutamiento de leucocitos, plaquetas y células sanguíneas rojas al endotelio vascular. Muchos de los efectos pro-inflamatorios del hemo han sido asociados con la activación de la señal TLR4, como ha sido demostrado en macrófagos. Sin embargo, la señal TLR4 activada por hemo aparentemente involucra mecanismos reguladores altamente complejos, los cuales dependen de los modelos aplicados y las condiciones experimentales.

   La activación de la señal TLR4  por el hemo ha sido estudiada primariamente en modelos de ratones con deficiencia genética de TLR4 y con pequeñas moléculas inhibidoras de TLR4. Por ejemplo, varios estudios demuestran que los macrófagos con deficiencia de TLR4 que son tratados con hemo exógeno purificado fallan en inducir la expresión de citoquinas pro-inflamatorias y la activación del inflamasoma. Por otra parte, en estudios con células renales embrionarias humanas, la aplicación conjunta de hemo y  LPS expresa efectos aditivos, sugiriendo que activan al TLR4 por mecanismos diferentes. Aunque este hallazgo apoya un rol directo del hemos en la señal TLR4, la identificación de un sitio para la unión del hemo en este receptor todavía no ha sido reportada. La activación celular dependiente de TLR4 por LPS requiere la interacción del TLR4 con el cofactor CD14, la proteína de diferenciación mieloide 2 (MD-2) y la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP). Aparentemente, la cooperación de estas proteínas también es crítica para la señal TLR4 dependiente de hemo. Más aún, en la MD-2 humana ha sido identificado un sitio de activación de hemo, el cual parece jugar un rol regulador crítico en  la señal TLR4. A diferencia de los LPS, algunos  ligandos pueden mediar la señal TLR4 sin la interacción directa con el receptor. Por ejemplo, el ácido hialurónico y el alérgeno Der p2 inducen la señal TLR4 de manera indirecta. Asimismo, la evidencia reciente indica que ciertos efectos pro-inflamatorios del hemo también ocurren de manera independiente a la unión directa al TLR4.

   Las propiedades pro-oxidantes del hemo libre pueden causar la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de la reacción de Fenton de Fe (II) y H₂O₂. Dado que la activación de TLR y la generación de ROS pueden ser complementarias en el estrés oxidativo, es posible que la generación de ROS inducida por el hemo puede también activar indirectamente la señal TLR4. Las ROS pueden oxidar rápidamente los fosfolípidos, lo cual a su vez inicia respuestas pro-inflamatorias vía TLR2 y/o TLR4. En este contexto, la inhibición de los efectos pro-inflamatorios inducidos por 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina oxidado (OxPAPC) ha sido reportada después de la regulación a la baja del TLR4.

   Las lipoproteínas de baja densidad oxidadas causan activación de TLR4 y el hemo pude unirse rápidamente a lipoproteínas oxidasa en el suero. Dado que la unión de hemo ocurre más rápido que a las proteínas ligadoras de hemo en el plasma (HBP) como hemopexina (Hx) y albúmina, es posible que las lipoproteínas puedan inducir señales inflamatorias mediadas por TLR4 y la expresión de citoquinas inflamatorias. Dependiendo del tejido, estos efectos inflamatorios pueden contribuir a la arterioesclerosis, enfermedades reumáticas y otras patologías.

  Debido a su naturaleza lipofílica, el hemo puede formar agregados e interactuar con la bicapa de fosfolípidos hidrofóbicos en las membranas afectando la señal TLR4. Las balsas lipídicas de la membrana son ensambles celulares dinámicos de esfingolípidos saturados, colesterol y proteínas. Hay algunas proteínas transmembrana localizadas en las balsas lipídicas incluyendo CD44 y CD36, las cuales están involucrados en la señal TLR4. Los datos indican que el TLR4 y las proteínas accesorias pueden asociarse con las balsas  lipídicas y que la asociación TLR4-balsa lipídica es estimulada por los LPS bacterianos. Dependiendo del ligando del TLR4, pueden estar involucrados diferentes co-receptores. Por ejemplo, la capacidad de los LPS para activar al TLR4 depende de CD14, una proteína anclada a glicofosfatidilinositol y co-receptor de MD-2 para el reconocimiento de LPS. Lo cual también puede controlar la internalización del hemo vía TLR4. Por otra parte, un reporte reciente indica que el co-receptor CD14 soluble puede mediar de los efectos pro-inflamatorios del hemo.

   La extracción o secuestro de colesterol altera la asociación del TLR4 con las proteínas accesorias en las balsas lipídicas  e inhibe la producción de TNF-α inducida por LPS. De acuerdo con un reporte reciente, el alto contenido de colesterol en las células rojas sanguíneas normales o enfermas proporciona protección contra el estrés oxidativo inducido por hemo libre y  la membrana dañada en condiciones normales y hemolíticas. Dado que la depleción de colesterol afecta el ensamble de la balsa lipídica, el tráfico en la membrana y la señal TLR4 es posible que el hemo libre o los complejos hemo-HBP específicas puedan tener efectos modulares sobre la señal TLR4 a través de las balsas lipídicas. El hemo, dependiendo de su estado conformacional puede ser incorporado en las  balsas lipídicas de la membrana plasmática, afectar en la balsa la fluidez de lípidos, la polaridad, el grosor y las propiedades de tensión, lo cual a su vez puede influir en el reclutamiento y la señal de TLR4. Entonces, a través de interacciones hidrofóbicas no específicas con las balsas lipídicas, el hemo solo o en asociación con HBP puede afectar la señal TLR4.

   La toxicidad del hemo libre y sus efectos pro-inflamatorios han sido demostrados en modelos experimentales de enfermedad como la enfermedad de células falciformes, malaria, sepsis, síndrome urémico hemolítico atípico, arterioesclerosis o daño por isquemia-reperfusión. Los efectos perjudiciales del hemo libre pueden ser bloqueados por factores intracelulares como hemo oxigenasa y ferritina, y factores extracelulares como varias proteínas plasmáticas incluyendo Hx, albúmina, α1- microglobulina (A1M) y α1-antitripsina (AAT). Solamente si los mecanismos intracelulares y extracelulares son superados, tiene lugar la toxicidad celular.  Varios reportes han proporcionado evidencia que la neutralización del hemo vía Hx, la proteína plasmática con la más alta afinidad de unión a hemo en humanos, contrarresta los efectos perjudiciales del hemo. Sin embargo, las concentraciones de Hx en plasma son bajas (alrededor de 0,6-1,2 g/L) y, en condiciones de hemólisis severa, los  disminuidos niveles sistémicos de Hx  pueden no ser suficientes para neutralizar las grandes cantidades de hemo libre. Por tanto, otras proteínas plasmáticas, incluyendo albúmina, A1M y AAT también están involucradas en la unión y neutralización del hemo libre. Aunque la albúmina se une al hemo con una afinidad aproximadamente 100 veces menor que la Hx, la alta concentración plasmática de albumina puede compensar cualquier potencial deficiencia en Hx. Esto, en parte, puede explicar los efectos beneficiosos de la infusión de albúmina a los individuos con sepsis severa.  La albúmina es una proteína de fase aguda negativa en humanos y es concebible que durante las condiciones de inflamación severa, cuando la capacidad neutralizante de hemo de la albúmina disminuye, participen otras proteínas de fase aguda como la AAT. La AAT es una HBP con afinidad de unión con el hemo similar a la de la albúmina que reduce marcadamente los efectos del hemo libre sobre la activación de neutrófilos, incluyendo la producción de ROS. Las HBP plasmáticas no solo unen y neutralizan hemo libre con diferentes afinidades, también adquieren nuevas actividades biológicas a través de interacciones específicas con el hemo. Por ejemplo, Hx y A1M exhiben funciones transportadoras de hemo diferentes y son reguladas recíprocamente durante la enfermedad de células sanguíneas falciformes. Mientras la Hx dirige el hemo hacia el hígado y media su captación vía proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad-1 (LRP-1, sinónimo con CD-91), la A1M dirige al hemo hacia el riñón donde puede causar efectos perjudiciales, incluyendo daño renal agudo. Por otra parte, la interacción de las inmunoglobulinas con el hemo puede alterar su afinidad de unión con los antígenos bacterianos. Entonces, los efectos pro-inflamatorios del hemo libre dependen de sus interacciones con HBP plasmáticas, las cuales pueden variar grandemente en diferentes condiciones fisiopatológicas.

   La hemoglobina libre y el hemo derivado de lisis de células sanguíneas rojas actúan sinérgicamente con los efectos pro-inflamatorios de agonistas TLR4 en cultivos de macrófagos de ratón. Estos hallazgos sugieren que el hemo libre puede agravar sustancialmente la respuesta inflamatoria en las infecciones bacterianas y virales con hemólisis intravascular simultánea. El hemo libre activa sinérgicamente al inflamasoma NLRP3 en macrófagos y células endoteliales. El inflamasoma NLRP3 es un complejo proteico multimérico que comprende un sensor, un adaptador y el zimógeno procaspasa-1, lo cual provoca la activación de la caspasa-1 y la liberación de las interleuquinas IL-1β e IL-18. El hemo activa al inflamasoma NLRP3 provocando la producción de IL-1β. Adicionalmente, el hemo libre puede contribuir a la activación inflamatoria del endotelio vía activación del complemento. Estos estudios proporcionan evidencia experimental que el hemo libre puede ser una importante señal secundaria   para las condiciones pre-existentes de activación endotelial pro-inflamatoria.

   Las respuestas a la activación del TLR4 en humanos y ratones tienen algunas similitudes, pero también profundas diferencias. Por ejemplo, el lípido A de las endotoxinas actúa sinérgicamente sobre el complejo TLR4/MD2 en ratones, pero no en humanos. El TLR4 humano y murino muestra 67-71% y 79-81% de similitud en los niveles de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente. En ratones y humanos, las células de origen mieloide como monocitos, macrófagos, microglias y granulocitos exhiben los niveles más altos de expresión de TLR4. Sin embargo, en claro contraste con los macrófagos y monocitos humanos, los cuales aumentan la expresión de TLR4 en respuesta a LPS, los macrófagos y neutrófilos de ratón disminuyen su expresión de TLR4 en respuesta a estimulación con LPS. Por otra parte, existen datos que sugieren que el cerdo y el conejo pueden ser más cercanos al humano que el ratón con relación a la secuencia y función del TLR4.  En efecto, humanos, cerdos y conejos son sensibles a LPS con cambios fisiológicos inducidos por una dosis de ng/ Kg mientras los ratones son altamente resistentes. Más aún, la Hx es inducida durante la respuesta de fase aguda en ratones, pero no en humanos. Otro ejemplo es la AAT, porque las concentraciones plasmáticas de AAT en ratones son aproximadamente cuatro veces mayores que en humanos, lo cual puede ser importante para neutralización y/o susceptibilidad de la toxicidad del hemo libre. Por tanto, no es sorprendente que la señal TLR4 de ratones y humanos exhiba sustanciales diferencias. 

   En conclusión, el hemo como grupo prostético de hemoproteínas tiene funciones celulares vitales, pero en su forma libre puede tener efectos pro-oxidantes y pro-inflamatorios. El hemo es un agonista de TLR4, el receptor para LPS, un componente bacteriano pro-inflamatorio. El rol regulador del hemo en la señal TLR4 puede depender de interacciones directas e indirectas. En particular, la interacción del hemo con HBP específicas juega un rol moderador mayor en condiciones inflamatorias. Debido a las diferencias entre las especies en la señal TLR4 dependiente de hemo, los hallazgos de  modelos de ratones en enfermedades inflamatorias experimentales deben ser cuidadosamente interpretados cuando son trasladados a situaciones clínicas.

Fuente: Janclauskiene et al (2020). TLR4 signaling by heme and the role of heme-binding blood proteins. Frontiers in Inmunology 11:1964.