Autofagia en homeostasis ósea

Las formas de vida tienen una naturaleza dinámica. En los organismos vivos, la energía constantemente es producida y consumida, y los compuestos químicos, incluyendo proteínas, grasas y azúcares están en constante síntesis y degradación.  Una ingesta estable de nutrientes y energía es indispensable para la supervivencia. Por mucho tiempo se consideró que  la energía o los nutrientes del ambiente externo eran la única fuente para el mantenimiento de la homeostasis. Más tarde, se reconoció que, en condiciones adversas, como el ayuno, el reciclaje de los compuestos químicos, incluyendo proteínas, grasas y minerales es una solución  para mantener la mínima cantidad de síntesis y producción de energía necesaria para la supervivencia. En este contexto, actualmente  sabemos que aún bajo condiciones fisiológicas normales, los sustratos para la mayoría de los procesos sintéticos intracelulares en el cuerpo derivan principalmente de la degradación, reformación y reutilización  de los contenidos que ya están presentes. Este proceso de reciclaje es activado principalmente a través de un proceso biológico llamado autofagia.

   La autofagia es un proceso catabólico intracelular altamente conservado durante la evolución, en el cual los componentes citoplasmáticos son degradados para la generación de nutrientes y/o energía.  Inicialmente, la función fisiológica de la autofagia era reconocida solamente como un medio de transporte de componentes intracelulares hacia los lisosomas. Sin embargo, a partir de la identificación de genes relacionados con la autofagia y moléculas involucradas en la dinámica de las membranas durante la autofagia, han ocurrido significativos progresos con relación a la participación de la autofagia en casi todos los procesos biológicos. La autofagia ha sido identificada como un factor clave en procesos fisiológicos y el inicio y progreso de condiciones patológicas relacionadas con la desregulación metabólica, incluyendo cáncer, desórdenes neurodegenerativos, envejecimiento y enfermedades óseas. En condiciones fisiológicas, la autofagia es responsable de la remoción  de los organelos dañados, mientras en condiciones patológicas, la autofagia ayuda en la redistribución de nutrientes intracelulares para satisfacer los requerimientos de energía para la supervivencia. La autofagia controla la homeostasis química de células simples y varios tipos de tejidos, incluyendo al tejido óseo.

   En los mamíferos, el hueso asume múltiples funciones, proporcionando protección a órganos vitales, adherencia para músculos esqueléticos, nicho para la síntesis de células sanguíneas, almacenamiento de iones minerales y secreción de hormonas. Para llevar a cabo estas funciones, el hueso se mantiene en un ciclo constante de remodelación mediada por tres diferentes tipos de células. De las  “stem cells” mesenquimales (MSC) derivan los osteoblastos que sintetizan y secretan la matriz ósea. Los osteoblastos embebidos en la matriz se diferencian en osteocitos, los cuales forman una red mecanosensible en el hueso. Por otra parte, los osteoclastos, multinucleados y derivados de “stem cells” hematopoyéticas, constantemente degradan y resorben la matriz ósea. En el inicio de la osteoclastogénesis, las células hemtopoyéticas mononucleares se fusionan una con otra para formar células gigantes multinucleadas. Normalmente, hay un balance dinámico y constantemente coordinado entre  formación y degradación de hueso. De esta manera, la masa, la estructura y la función del hueso son sensibles a estímulos intrínsecos o extrínsecos. Cuando el equilibrio entre formación de hueso y degradación de hueso es alterado, ocurren condiciones patológicas. La excesiva formación de hueso provoca sobre mineralización y excesiva masa ósea, la cual es llamada osteopetrosis. Sin embargo, cuando predomina el balance hacia la degradación de hueso, el incremento de pérdida ósea provoca reducción de la masa ósea y una estructura indeterminada del hueso, la cual frecuentemente es llamada osteoporosis. La osteoporosis es una enfermedad ósea sistémica degenerativa que se caracteriza por progresiva pérdida de masa ósea y significativa degradación de las propiedades mecánicas del hueso, lo cual posteriormente provoca fragilidad ósea y susceptibilidad a fracturas. Este fenómeno usualmente se correlaciona con el progreso del envejecimiento y afecta significativamente la calidad de vida y la longevidad de la población adulta mayor.

   Considerando la propiedad de reciclaje de la autofagia y los procesos dinámicos de síntesis y degradación en el hueso, no es sorprendente que la autofagia esté altamente involucrada en el metabolismo óseo. Los tres tipos de células óseas, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos poseen un nivel basal de actividad autofágica. Los múltiples componentes de la ruta autofágica contribuyen a la supervivencia y funcionamiento de las células óseas. La evidencia sugiere que un apropiado nivel de autofagia contribuye a la supervivencia de las células óseas en ambientes hipóxicos, deficientes en nutrientes o hipertónicos. Además de la supervivencia, el nivel de actividad autofágica está asociado con la diferenciación de pre-osteoblastos, la transición osteoblasto-osteocito y la génesis y función de osteoclastos. Por otra parte, la evidencia reciente sugiere que la autofagia juega un rol fundamental en el inicio y progreso de la osteoporosis. La relación entre autofagia y osteoporosis fue establecida en un estudio de densidad mineral ósea de humanos donde se identificaron correlaciones significativas entre múltiples genes reguladores de la autofagia y la densidad mineral ósea. Adicionalmente, la modulación selectiva de genes relacionados con la autofagia en células óseas es suficiente para recapitular el estado osteoporótico en modelos animales. Al mismo tiempo, la modulación de la actividad autofágica tiene un potencial valor terapéutico para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis.

   La autofagia es una ruta lisosomal responsable del reciclaje de organelos celulares innecesarios y el exceso de nutrientes, y la eliminación de  desechos metabólicos y patógenos intracelulares. Este proceso de “auto-comida” intracelular juega un rol crítico en el mantenimiento de la supervivencia de múltiples linajes celulares. En los mamíferos, se han descrito tres tipos de autofagia con distintas características morfológicas y diferentes mecanismos reguladores: autofagia mediada por chaperona, microautofagia y macroautofagia. En la autofagia mediada por chaperona, las proteínas citoplasmáticas no son secuestradas y son llevadas a los lisosomas por proteínas chaperonas más que por estructuras membranosas. En la microautofagia, el lisosoma captura directamente una pequeña cantidad de citoplasma y forma invaginaciones en su membrana,  requiriendo  poca asistencia de organelos fuera del lisosoma. En la macroautofagia, la captura y el manejo de sustancias intracelulares son simbolizadas  por la formación de autofagosomas. Los autofagosomas están constituidos por membranas de nueva formación y pueden encerar organelos dañados, patógenos intracelulares y agregados proteicos para activar el proceso de secuestro. Los autofagosomas son incorporados por los lisosomas para finalizar el manejo y la digestión del contenido. La macroautofagia es regulada por un grupo de genes, llamado  genes relacionados con la autofagia (Atg), que incluye aproximadamente 20 miembros. Entre los tres tipos de autofagia, la macroautofagia tiene la más fuerte conexión con la biología celular, la fisiología y las enfermedades.

   La autofagia trabaja concertadamente con el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) para mantener la homeostasis celular. El proceso autofágico comprende cuatro etapas: iniciación/nucleación, elongación, degradación y finalización. La autofagia comienza con la activación del complejo ULK1, el cual está compuesto por ULK1, ATG13, ATG101 y FIP200. En el inicio de la autofagia, el ULK1 es desfosforilado y el complejo ULK1 se disocia del complejo blanco de rapamicina de mamíferos 1 (mTORC1). El complejo ULK1 activado recluta otro complejo multiproteína  conocido como complejo fosfatidilinositol 3- quinasa (PI3K) clase III al sitio de inicio de la autofagia. El complejo PI3K está compuesto por beclin-1, Vps15, Vps34, Ambra1, UVRAG y más. Ambra1 interactúa con TRAF6 y permite la auto-asociación y estabilización de estos complejos. En este proceso, se forma un fragmento de membrana usualmente conocido como fagoporo. En la próxima etapa, las proteínas ATG participan en la elongación del fagoporo. La agregación de  proteínas ATG forma un sistema de conjugación similar a ubiquitina: ATG12-ATG5-ATG16L, el cual facilita el ensamble de la cadena ligera de la proteína asociada a microtúbulo 1A/1B 3 (LC3) con el fosfolípido fosfatidiletanolamina (PE). El complejo LC3-PE, conocido también como LC3-II se incorpora en la membrana del fagoporo y contribuye a la elongación y cierre del autofagosoma. Los autofagosomas maduran por fusión con componentes endocíticos intracelulares, incluyendo endosomas y lisosomas, volviendo ácido el ambiente dentro del autofagosoma. Las proteínas involucradas en el transporte vesicular, como dineína, y la fusión de la membrana, incluyendo Rab7, SNARES y ESCRT facilitan la maduración de los autofagosomas. Algunas proteínas de la superficie del autofagosoma, incluyendo p62, optineurina, NDP52, NBR1 y Alfy son responsables del secuestro y degradación de los componentes intracelulares. Durante la etapa de degradación, las macromoléculas intracelulares atrapadas son degradadas en aminoácidos, lípidos, nucleótidos y energía para futuros procesos intra y extracelulares. La finalización de la autofagia es activada a través de un mecanismo de retroalimentación negativa. Los nutrientes producidos en el autofagosoma reactivan la ruta mTOR, la cual genera túbulos o vesículas proto-lisosomales. Estos túbulos y vesículas salen de los autolisosomas y eventualmente maduran  nuevamente en los lisosomas. El proceso de finalización sirve como cierre de la maquinaria  autofágica y ha sido validado en varias especies.

   Por mucho tiempo, la autofagia ha sido reconocida como no selectiva para la degradación de sustratos. Mientras esto es a menudo cierto cuando la autofagia es inducida en condiciones de estrés como el ayuno, la evidencia reciente sugiere que la autofagia requerida durante el mantenimiento de la homeostasis celular puede ser altamente específica. La mejor demostración de la degradación autofágica selectiva es la proteína ligadora de ubiquitina SQSTM1, también llamada p62, en la superficie del autofagosoma. La p62 puede capturar proteínas ubiquitinizadas y unirlas al componente de membrana LC3-II. Mientras estos sustratos son manejados en el interior del autofagosoma, la p62 también es internalizada y degradada. La p62 es considerada uno de los mayores sustratos digestivos para los autofagosomas y, por tanto, el incremento en la expresión de p62 usualmente indica una disminución en el proceso autofágico. La autofagia involucrada en la ubiquitinización es más activa en el aclaramiento de bacterias. Cuando los patógenos son específicamente atrapados y digeridos durante la autofagia, el proceso es llamado xenofagia. Otro blanco selectivo para la autofagia es la mitocondria y el proceso de degradación autofágica específico es llamado mitofagia. La mitofagia es responsable del recambio rutinario de mitocondrias en condiciones normales.

   La autofagia es iniciada por señales fisiológicas o estímulos patológicos. En el nivel fisiológico basal, el proceso autofágico es constitutivo en un nivel bajo en todas las células y sirve como un mecanismo de control de calidad para remover organelos y proteínas dañados. El nivel basal de actividad autofágica varía entre los diferentes linajes celulares y tipos de tejidos. Generalmente el nivel basal de autofagia es más crítico para las células altamente o terminalmente diferenciadas, como neuronas, miocitos y osteocitos. Un amplio rango de estresores, incluyendo ayuno de nutrientes o energía, hipoxia, disturbios en el nivel de factores de crecimiento o invasión de patógenos inducen un aumento en la tasa de autofagia para   reciclar componentes citoplasmáticos en metabolitos y procesos biosintéticos, o para eliminar patógenos, permitiendo la supervivencia celular. En la mayor parte de condiciones, la autofagia sirve como citoprotector, pero potencialmente puede volverse perjudicial si es descontrolada. La disfunción autofágica está asociada con una variedad de condiciones patológicas humanas, incluyendo desórdenes y enfermedades óseas.

   El desarrollo, crecimiento y mantenimiento del esqueleto están en balances dinámicos y son altamente sensibles a factores, incluyendo estímulos mecánicos y fluctuaciones hormonales.  Entre las células con una alta capacidad de secreción, la autofagia controla la localización espacial de complejos de señalización críticos para la síntesis de proteínas. Esta localización espacial intracelular ha sido revelada en la activación de las rutas de señalización Wnt y NF-κB vía degradación autofágica de componentes específicos de tales rutas. Dado que estas rutas son críticas para la diferenciación de osteoblastos y osteoclastos, la importancia  de la localización espacial regulada por autofagia en la regulación de las funciones anabólicas y catabólicas de las células óseas es aparente.  Los osteoblastos son los constructores primarios de hueso y su supervivencia y funcionamiento están regulados por la autofagia. La activación de la autofagia está correlacionada con la diferenciación osteogénica de las MSC a través de la ruta de señalización AMPK. Un apropiado nivel de autofagia es un prerrequisito para el mantenimiento de la homeostasis y supervivencia de los osteoblastos. La regulación a la baja de la autofagia provoca un incremento de estrés oxidativo en los osteoblastos, mientras la regulación  al alza de la autofagia en estas células se correlaciona con reducción del estrés oxidativo y disminución de la apoptosis. Los datos experimentales sugieren que el daño causado por el estrés oxidativo a los osteoblastos puede ser aliviado por el inicio temprano de la autofagia, la cual es activada a través de la ruta de estrés de retículo endoplásmico. Adicionalmente, la autofagia protege a los osteoblastos de varios estímulos tóxicos. Por ejemplo, un alto nivel de  autofagia reduce la muerte de osteoblastos expuestos a cloruro de plomo. Además de la supervivencia de los osteoblastos, la autofagia está íntimamente relacionada con la mineralización ósea. La prueba más directa del rol de la autofagia en la mineralización ósea es la identificación de cristales de apatita en vacuolas autofágicas. La inhibición de la autofagia bloquea el transporte de minerales de los osteoblastos a la matriz ósea. La autofagia también está activamente involucrada en rutas de señalización importantes para la osteogénesis. Por ejemplo, el factor de crecimiento similar a insulina-I (IGF-I) estimula la diferenciación  osteogénica de osteoblastos y su función es activada, al menos en parte, a través de la AMPK y la regulación al alza de la autofagia. Adicionalmente, una de las cascadas pro-osteogénicas  inducidas por la proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2) involucra la activación del factor Atg7 relacionado con la autofagia, el cual actúa sobre Wnt16 para activar a la metaloproteinasa 13 y eventualmente la diferenciación osteoblástica.

   Además de los osteoblastos, los condrocitos son otra población de células crítica para el crecimiento del esqueleto. Excepto por la región craniofacial, los huesos largos se forman y crecen vía formación endocondral de hueso durante la cual los condrocitos muestran hipertrofia y secreción de la matriz.  Los estudios in vitro revelan que la diferenciación y mineralización de condrocitos se correlaciona positivamente con el nivel de actividad autofágica. Durante el crecimiento postnatal de ratones, el nivel de autofagia se correlaciona con la secreción de colágeno tipo II, el mayor componente de la matriz cartilaginosa.

   Por otra parte, múltiples rutas de factores de crecimiento con evidente capacidad reguladora en el hueso están relacionadas con la actividad autofágica. Las BMP son reconocidas como fuertes factores osteogénicos y se unen directamente a receptores en la superficie de los osteoblastos y activan procesos de formación de hueso a través de la señal intracelular SMAD. La función paracrina de las BMP es ajustada por el nivel de sus antagonistas extracelulares noggina, chordina y esclerostina. Las BMP pueden antagonizar el efecto de la noggina sobre la cadena ligera 3 de la proteína 1 asociada al microtúbulo (MAP1LC3)-II y posteriormente  incrementar los niveles de Beclin-1y la proteína de membrana asociada a lisosoma 2 ( Lamp2). De esta manera, los ligandos BMP podrían estar involucrados en la regulación de los niveles de autofagia.

   La señal Wnt canónica dependiente de β-catenina es otra ruta osteogénica que ha sido asociada con la autofagia y es crítica para la diferenciación de osteoblastos. La ruta de señalización Wnt está asociada negativamente con la autofagia. Más aún, la activación de la señal Wnt puede suprimir la actividad autofágica e incrementar la apoptosis de osteoblastos y condrocitos. Por otra parte, múltiples proteínas relacionadas con la autofagia, como NBR y SQSTM1,  tienen influencia directa en la biología de los osteoblastos. Asimismo, dos familias de factores de transcripción con evidentes funciones en la actividad autofágica están involucradas en la supervivencia, diferenciación y función de los osteoblastos. Miembros de la familia del factor de transcripción FOXO (forkhead box O) están profundamente involucrados en la biología celular incluyendo proliferación, diferenciación, hipertrofia, reparación de ADN, reciclaje de energía y metabolismo de la glucosa. La activación de FOXO aumenta el nivel de autofagia a través de la unión directa a las regiones promotoras de genes relacionados con la autofagia. El factor de transcripción activante 4 (ATF4) de la familia de proteínas de unión con el elemento de respuesta de cAMP (CREB) también está relacionado con la función de los osteoblastos y la actividad autofágica. El ATF4 es requerido en la formación de hueso y la diferenciación terminal de osteoblastos. Al mismo tiempo, el ATF4 protege a las células del ayuno de aminoácidos aumentando la ingesta de aminoácidos en las células y aumenta la supervivencia y viabilidad celular, regulando al alza la transcripción de varios genes relacionados con la autofagia.

   La autofagia también es esencial cuando los osteoblastos son incorporados en la matriz ósea y terminan diferenciándose en osteocitos. Los osteocitos son células de muy larga vida, terminalmente diferenciadas y embebidas en nichos delimitados por matriz ósea mineralizada. Morfológicamente, los osteocitos están más cercanos a las neuronas que a otras células óseas. La principal función fisiológica de los osteocitos es actuar como el sistema mecanosensible del esqueleto. Los procesos similares a dendritas de los osteocitos forman una red y convierten los estímulos mecánicos en el hueso en señales biológicas que posteriormente regulan la remodelación ósea. La autofagia tiene varios roles en la diferenciación de los osteocitos. Primero, los osteoblastos tienen una transición en la morfología y composición que requiere del reciclaje activo de organelos. Segundo, con la limitada perfusión sanguínea en la matriz mineralizada, los osteocitos son más susceptibles a la hipoxia y al estrés oxidativo, lo cual requiere actividad autofágica.  Específicamente, los osteocitos dependen de la autofagia para sobrevivir a múltiples factores adversos, incluyendo altos niveles de ROS e hipoxia. Más aún, la evidencia reciente sugiere que los osteocitos demuestran mayor actividad autofágica que sus progenitores. El nivel de expresión de LC3 en los osteocitos es significativamente mayor que en los osteoblastos.

   La resorción ósea es conducida por los osteoclastos, los cuales se polarizan para formar un borde fruncido en la interfase célula-hueso. Numerosos compartimentos se forman debajo del borde fruncido, a través del cual las enzimas degradativas son secretadas en la superficie ósea. La matriz ósea degradada es transportada a los osteoclastos vía endocitosis para su reciclaje. La autofagia está activamente involucrada en la diferenciación y función de los osteoclastos. Cuando se activa la resorción ósea, los osteoclastos terminalmente diferenciados se adhieren a la superficie ósea y tal adherencia es activada a través de estructuras especializadas formadas en el lado de contacto de los osteoclastos llamadas podosomas. Las proteínas funcionales incluyendo los filamentos de actina, actina F y monómeros de actina, sirven como anclas para la adherencia de los osteoclastos. La resorción ósea es acompañada por la generación y secreción de lisosomas que contienen ácido y proteasas. Los lisosomas migran al borde fruncido entre osteoclasto y superficie ósea, se fusionan con la membrana celular en los podosomas y externalizan HCl y proteasas. El ácido disuelve el contenido mineral del hueso y las proteasas, incluyendo metaloproteínasas de la matriz, descomponen la matriz de colágeno. Las proteínas relacionadas con la autofagia ATG5, ATG7, ATG4B y MAP1LC3 juegan roles críticos en la activación de la función de los osteoclastos en la resorción ósea. Por ejemplo, los datos in vivo e in vitro sugieren que ATG5 y ATG7 promueven la función de los osteoclastos y guían a los lisosomas hasta el anillo de actina. Adicionalmente, la modulación de MAP1LC3 por ATG4B bloquea la expresión y actividad de catepsina K.

   En conclusión, la autofagia es un proceso intracelular, en el cual componentes celulares son selectivamente digeridos para el reciclaje de nutrientes y energía. El catabolismo autofágico modula el mantenimiento y la función de osteoblastos, osteocitos y osteoclastos y es crítico para el mantenimiento de la homeostasis del esqueleto. La actividad autofágica aberrante provoca la disrupción del balance formación-resorción en el hueso, lo cual se manifiesta como estados patológicos, incluyendo osteoporosis y osteopetrosis.

Fuente: Yin X et al (2019). Autophagy in bone homeostasis and the onset of osteoporosis. Bone Research 7: 28.