Roles de FGF en el desarrollo del folículo ovárico

El desarrollo del folículo ovárico de prenatal a preovulatorio es altamente complejo e involucra  múltiples rutas de señalización endocrinas y paracrinas. Las gonadotropinas  hipofisarias son los principales disparadores del desarrollo de los folículos  ováricos, pero varias familias  de factores de crecimiento también tienen roles importantes, incluyendo factores de crecimiento de fibroblasto (FGF).  En los mamíferos, la familia FGF  consiste de 18 proteínas secretadas (y cuatro proteínas intracelulares llamados factores homólogos  de FGF) agrupados en subfamilias  de acuerdo  a su secuencia homóloga y filogenia y los miembros de la misma subfamilia tienen similares propiedades de unión al receptor. En el folículo ovárico, las células tecales son  mesenquimales  y las células granulosas son epiteliales, por lo tanto los FGF paracrinos  pueden tener un rol  en el desarrollo del folículo. Hay evidencia que el FGF2 actúa sobre las células granulosas para promover la proliferación celular y disminuir la apoptosis y la esteroidogénesis.  Otros FGF han sido implicados  en la función del ovario y el desarrollo de los folículos. La expresión de algunos miembros de la familia FGF en el ovario es  específica para un tipo de célula; por ejemplo, el FGF7 es expresado en células tecales pero no en células granulosas  u oocitos.

La mayoría de los FGF  son factores paracrinos, aunque la subfamilia FGF19 (FGF19, FGF21 y FGF23)  son factores endocrinos con roles en la homeostasis del colesterol, la vitamina D y el fosfato. La mayor parte  de las proteínas  FGF poseen un péptido señal  y son secretadas a través  de la convencional ruta  retículo endoplásmico-Golgi,  aunque el FGF1 y el FGF2 son secretados  a través de una ruta que involucra la translocación  a la membrana celular  y la unión a proteoglucanos  de la superficie celular. Los receptores de los FGF (FGFR) son de la clase de receptores  tirosina quinasa que derivan de cuatro genes principales,  FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4.  Eventos de “splicing” alternativo resultan en dos variantes de FGFR1, FGFR2 y FGFR3 comúnmente llamadas formas “b” y “c”. Estas variantes tienen  propiedades de unión al ligando marcadamente diferentes. Por ejemplo, los miembros de la familia FGF7  (FGF3, FGF7, FGF10 y FGF22) activan la forma “b”  -pero no la forma “c”- de FGFR1 y FGFR2, mientras otros FGF activan la forma “c”. En general, las forma “b”  de las proteínas FGFR son expresadas en tejidos epiteliales y las formas “c” son expresadas en células mesenquimales.

La actividad biológica de los FGF depende de sus interacciones con la matriz extracelular (MEC). Para activar sus receptores (FGFR), los FGF paracrinos necesitan  unirse a heparan sulfato (HS), el cual  es un polisacárido sulfatado lineal  presente en la MEC y en la superficie celular donde está unido a  proteínas solubles (ej: perlecan) o proteínas de membrana (ej: sindecan, glipican) colectivamente conocidas como HS proteoglucanos (HSPG). FGF y FGFR  se unen a HS, lo cual incrementa la afinidad de unión del receptor  y estabiliza el complejo FGF-FGFR. Los FGF paracrinos son inactivos cuando se aplican a líneas celulares deficientes en HSPG y la adición de heparina o su HS restaura la actividad biológica de los FGF. La señal mesenquimal-epitelial de los FGF es más evidente  en órganos en desarrollo.  En una extremidad en desarrollo, el FGF10 secretado por el mesénquima activa FGFR2b en el borde ectodérmico apical,  una etapa temprana critica en la formación de la yema de la extremidad. En el desarrollo del pulmón de ratón, la activación del FGR2b epitelial  por el FGF10 mesenquimal  epitelial  es esencial para la ramificación  de las vías áreas  y la activación del FGFR2c por el  FGF18  mesenquimal es esencial para el desarrollo alveolar. Un nivel adicional de control  de los órganos en desarrollo  es ejercido por las diferencias  en la actividad biológica  de los miembros de la misma subfamilia de FGF. Por ejemplo, el FGF7 induce la ramificación  de las yemas de la extremidad mientras el FGF10 induce la elongación de las yemas. Otro ejemplo, el FGF18 estimula la expansión en el cerebro medio embrionario mientras el  FGF8 estimula la diferenciación  del cerebro medio en cerebelo.

A diferencia de los pulmones y las extremidades que se desarrollan una sola vez, el ovario postnatal de los mamíferos es un sitio de constante desarrollo  de folículos a partir del “pool” de folículos primordiales. Estos folículos consisten de un oocito inmaduro rodeado por una capa simple de células epiteliales escamosas “pre-granulosas”. Para convertirse en folículos en crecimiento, las células pre-granulosas escamosas  necesitan desarrollarse en células granulosas cuboidales  y proliferar, al tiempo que el folículo adquiere una capa de células tecales. En la medida que se forma el antro, las capas de células epiteliales y mesenquimales  proliferan  y esto en parte es regulado por la comunicación mesenquimal-epitelial. Ciertas características de la señal de las subfamilias FGF7 y FGF8 en el folículo preantral se asemejan a las que ocurren en el pulmón y las extremidades. Sin embargo, hay muy pocos estudios de estos FGF en folículos preantrales. Hay mucha más información  acerca del rol  de los FGF en la señal mesenquimal-epitelial  en los folículos antrales. El FGF10 es expresado predominantemente en células tecales y el FGFR2b es detectado predominantemente en células granulosas. El FGF18 es también detectado  en células tecales aunque la expresión de FGFR2c y FGFR3c es detectable en células granulosas y tecales. 

El FGF10 ha sido descrito en el folículo antral y tiene un patrón de expresión diferente al de FGF7. Mientras el FGF7  está restringido a la capa tecal, el FGF10 ha sido identificado en células tecales y oocito.  Es interesante destacar que ambas proteínas han sido detectadas en folículos preantrales, los cuales no contienen células tecales, lo  que sugiere que puede ocurrir un “switch” en la localización  una vez que los folículos  se vuelven antrales. Más aún, mientras los niveles de FGF7 no son alterados en folículos sanos, los niveles de FGF10 son significativamente mayores en células tecales de folículos menos estrogénicos (atrésicos) que en folículos altamente estrogénicos. Por otra parte, la adición de FGF10  a células granulosas inhibe la secreción de esteroides y la inyección de FGF10 directamente  en el folículo en crecimiento causa la regresión  del folículo.  La presencia de FGF10  en el oocito ha dado lugar  a varios estudios sobre su rol   en la función  de las células del cúmulus  y la maduración del oocito.  La adición de FGF10 exógeno  a complejos cumulus-oocito de bovino  durante la maduración in vitro  incrementa la expansión del cúmulus  y la tasa de desarrollo  del blastocisto. Adicionalmente, se ha demostrado que el FGF10 exógeno estimula la captación de glucosa y disminuye el nivel de apoptosis  en los oocitos durante la maduración in vitro.  Se desconoce si el FGF7 tiene el mismo efecto.  Los efectos de FGF7 y FGF10  sobre el crecimiento in vitro de folículos preantrales han sido explorado por varios laboratorios.  En ratas, el FGF7  estimula el desarrollo  de folículos primarios mientras el FGF10  estimula el desarrollo de folículos primarios  en cabras. Muy poco se conoce acerca del rol  de los otros  miembros  de la familia FGF7 (FGF3 y FGF22) en el ovario.

La familia FGF8 incluye  FGF17 y FGF18  además del prototipo FGF8 y han sido detectados en oocitos, células tecales y células granulosas. Los principales receptores  de estos FGF han sido localizados en células granulosas y tecales.  En el ovario de ratón, el FGF8  inhibe la secreción de estradiol en las células granulosas pero no tiene efecto sobre la secreción de progesterona. El efecto de FGF17 y FGF18 sobre las células granulosas ha sido explorado en  ovario de gata, ambos FGF inhiben la secreción de estradiol y progesterona.  Las acciones pro-apoptosis  de los FGF son raras, pero el FGF18 es considerado un factor pro-apoptosis. Varios estudios sugieren que el FGF18 activa una ruta apoptótica a través del FGFR3c en células granulosas y otros tipos de células.

Las rutas intracelulares usadas por los FGF han sido estudiadas en una variedad  de líneas celulares. La unión del ligando provoca la activación del FGFR, el cual una vez activado se dimeriza  y el cambio conformacional  en la estructura del receptor  causa la autofosforilación  de residuos tirosina específicos. En estas condiciones se activan principalmente dos rutas de señalización: la fosforilación de MAPK vía fosfolipasa C y la activación de la fosfatilinositol-3-quinasa que a su vez activa las rutas Akt y proteína quinasa C (PKC). Esto resulta en la expresión  de genes de respuesta inmediata  como la familia Sprouty (SPRY) de reguladores negativos de receptores tirosina quinasa, el receptor nuclear orfan 4A y la familia ETS de factores de transcripción. Estas rutas de señalización son activas en células granulosas, principalmente cuando el ligando  es el FGF2. En las células granulosas de rata, el FGF2 estimula  la señal de calcio  a través de una ruta  dependiente de la PKC y en células granulosas de bovino, el FGF2  estimula la fosforilación  de MAPK3/1 y Akt. En células granulosas humanas, el FGF2 pero no el FGF4 o el FGF10, incrementa los niveles de SPRY2, mientras en células granulosas de bovino, FGF2 y FGF4 estimulan los niveles de SPRY2. Varios estudios han demostrado  que el FGF8 estimula la fosforilación  de MAPK3/1 y los niveles de SPRY2 en células granulosas/cúmulus de  humano, rata y ratón. En una comparación  de las rutas de señalización de FGF8 y FGF18 en células granulosas de bovino se demostró  que el FGF8  activa las típicas respuestas  FGF incluyendo  la fosforilación  de MAPK3/1 y la rápida y transitoria expresión de SPRY2, mientras el FGF18 no altera ninguna  de estas rutas. Sin embargo, la diferencia más interesante  entre ambos FGF es la estimulación por FGF8 –y la marcada inhibición por FGF18- de la expresión del gen GADD45B. La disminución de la expresión  de GADD45B ha sido relacionada con incremento de la apoptosis en varios tipos de células y puede ser parte del mecanismo  usado por el FGF18 para incrementar la apoptosis  en las células granulosas.

La evidencia acumulada sugiere potenciales roles para miembros de las familias FGF7 y FGF8 en el crecimiento y desarrollo  de folículos preantrales/antrales y que algunos FGF de la misma subfamilia que activan a los mismos receptores tiene efectos biológicos marcadamente diferentes sobre sus células blanco. Tales diferencias entre FGF relacionados  han sido descritas durante el desarrollo embrionario y entre ellas destacan las diferencias reportadas entre FGF7 y FGF10 y entre FGF8 y FGF10.  La morfogénesis de la ramificación se refiere al crecimiento y ramificación  de estructuras tubulares en tejidos como el pulmón, el riñón y las glándulas salivares.  En estos tejidos,  FGF7 y  FGF10 juegan roles distintos; el FGF7 induce la expansión  o ramificación  de yemas epiteliales mientras el FGf10 induce la elongación de las yemas. Por la subfamilia FGF8, el FGF18 estimula la expansión  en el cerebro medio embrionario, mientras el FGF8 transforma el cerebro medio en cerebelo. La literatura actual sugiere que estas  distintas actividades biológicas pueden ser dirigidas por (i) señales intracelulares diferentes y/o (ii) interacciones entre los FGF, los FGFR y  los HSPG.

El ARN mensajero que codifica al FGF8 -pero no al FGF18- por “splicing” alternativo genera proteínas  con diferentes N-terminal. Estos eventos  resultan en una forma corta (FGF8a) y una forma larga (FGF8b) entre otras y el FGF8b recombinante  ha sido usado en estudios del ovario. FGF8a y FGF8b  difieren en su actividad biológica, el FGF8a induce la expansión del cerebro medio embrionario (de manera similar al FGF18), mientras el FGF8b  transforma el cerebro medio embrionario en cerebelo. El FGF8b  provoca una fuerte activación  de MAPK3/1 en el cerebro medio, mientras FGF8a resulta  en un nivel menor de fosforilación  de MAPK3/1. Los datos de los estudios con células granulosas bovinas  demuestran que el FGF8b resulta en una fuerte y transitoria fosforilación de MAPK3/1 mientras la adición  de FGF18 provoca una respuesta débil. La diferencia  en las actividades  de FGF8a y FGF8b han sido atribuidas a un residuo fenilalanina (F32) presente en el N-terminal  de FGF8b que permite una fuerte unión con el receptor. F32 está ausente  en el FGF8a  lo que da lugar a un débil complejo  de unión con el receptor. Sin embargo, esto no es una explicación satisfactoria  de la diferencia entre FGF8a y FGF8b pues el FGF18 contiene el residuo F32 presente en el FGF8b. Es sabido que las dicotomías débil vs fuerte y transitoria  vs sostenida activación de MAPK3/1 permiten respuestas celulares distintas, dirigiendo las células hacia proliferación o apoptosis  de una manera específica de contexto celular. Esto puede explicar en parte las respuestas diferentes  de las células granulosas a las acciones de FGF8b y FGF18.  

FGF10 y FGF7 se unen  a HSPG y el HS altera selectivamente  la actividad biológica de FGF7/FGF10. Estos FGF tienen diferente afinidad de unión a la MEC, el FGF7 -pero no el FGF10- difunde rápidamente   a través de la MEC. La adición de heparina a los cultivos de células inhibe la actividad mitogénica de FGF7 pero estimula la de FGF10.  El HS también es esencial para la subfamilia FGF8, la adición de FGF8 a células deficientes en HS no estimula la proliferación celular o la fosforilación de MAPK3/1, mientras con el co-tratamiento con heparina estas actividades son evidentes. Sin embargo, la presencia o ausencia de HS no es la historia completa, el tipo de cadena  HS también puede alterar la actividad biológica de los FGF. Por ejemplo, el perlecan derivado de células endoteliales estimula la proliferación inducida por FGF18 en mayor grado que el perlecan derivado de condrocitos. El tipo de HS también altera  la capacidad de un FGF para activar a un receptor específico, las cadenas sacáridas cortas son suficientes para permitir al FGF1 activar al FGFR2b, mientras las cadenas sacáridas largas  son requeridas para la activación del FGFR2b por FGF7. ¿Cómo impacta esto la señal  FGF en el folículo? Los folículos antrales contienen numerosos proteoglucanos y las células granulosas  producen HSPG. Las celulas tecales están separadas de las granulosas por una membrana basal que contiene perlecan y otros componentes, el nivel de estos componentes cambia con el crecimiento del folículo. Adicionalmente, una forma particular de MEC (focimatriz) que contiene perlecan  ocurre como agregado en la capa de células granulosas. Los niveles de perlecan cambian durante el desarrollo del folículo y los niveles de HSPG en la focimatriz de la capa de células granulosas son significativamente mayores  en folículos atrésicos en comparación con folículos sanos.  Más aún, el SHPG del folículo es sulfatado y, al menos en la vaca, la cantidad de sacáridos derivados de HS cambia durante el desarrollo del folículo y la atresia.  Los agregados de focimatriz pueden jugar un rol  en la regulación de la bioactividad de FGF10  o FGF18 en la capa de células granulosas y los cambios  en la sulfatación de perlecan durante el crecimiento/atresia del folículo puede disminuir o aumentar las potenciales acciones pro-apoptosis del FGF18.

En conclusión, la señal FGF en los tejidos en desarrollo es altamente regulada en múltiples niveles: transcripción de genes, splicing alternativo, activación de distintas rutas intracelulares y la presencia de patrones de sulfatación específicos en las proteínas de la MEC. En el ovario, FGF7 y FGF10 pueden tener efectos diferentes sobre las células granulosas en comparación con el FGF18. Aunque FGF7 y FGF10 se unen al mismo receptor FGFR2b, tienen diferente afinidad por HS lo que causa  una divergencia de los eventos de fosforilación del receptor  entre estos dos ligandos.  Las diferencias en los efectos biológicos  de FGF8 y FGF18  sobre las células granulosas  pueden estar relacionadas con la naturaleza de la sulfatación de los HSPG.

Fuente: Price CA (2016). Mechanisms of fibroblast growth factor signaling in the ovarian follicle. Journal of Endocrinology 228: R31-R43.