Cooperación metabólica en el folículo ovárico

Los oocitos humanos se desarrollan en los folículos ováricos, rodeados por células granulosas (CG). El desarrollo coordinado de todos los tipos de células de un folículo es crucial para la posibilidad de ovular un huevo fértil y por consiguiente para la reproducción normal o asistida. Los detalles de la interacción  metabólica con las rutas de señalización son útiles para la prevención y tratamiento de la infertilidad y para el mejoramiento de  los métodos de reproducción asistida. Las CG crean una clase de barrera protectora y una plataforma de comunicación entre el oocito y el microambiente extra-ovárico. Ellas proporcionan nutrientes y moléculas de señalización para el oocito y juegan un rol esencial durante la penetración del espermatozoide. Estos hechos hacen a las CG atractivas para la investigación porque el conocimiento de su función esencial en la reproducción y su metabolismo pueden proporcionar un mejor entendimiento sobre cómo las CG protegen al oocito durante la maduración y cómo contribuyen al desarrollo normal de un embrión humano.

   Los folículos ováricos primordiales están presentes en el nacimiento como una reserva de oocitos primarios para la vida reproductiva de la mujer. Los oocitos, en el estadio de folículo primordial, se encuentran en la profase de la primera división meiótica y rodeados por una capa simple de CG escamosas. La maduración de los folículos ováricos (foliculogénesis) continúa con el desarrollo de los folículos primordiales primarios en folículos secundarios antrales grandes. Los folículos comienzan como sacos esferoidales llenos con líquido folicular y conteniendo oocitos. Los oocitos en los folículos primarios preantrales  están rodeados por una capa simple de células cuboidales llamadas CG preantrales. Los folículos primarios gradualmente se desarrollan en folículos secundarios formando el antro mientas al mismo tiempo los oocitos crecen en tamaño. Durante este proceso, las CG incrementan su actividad mitótica. Ellas se dividen en dos poblaciones: (1) células granulosas murales (CGM) que forman la pared del antro y (2) la población de células granulosas del cúmulus (CGC) que rodean al oocito.

   En humanos, cuando un folículo alcanza el tamaño de folículo de De Graaf y el oocito alcanza aproximadamente  100 µm de diámetro, se inicia la ovulación después de un pico pre-ovulatorio de hormona luteinizante (LH). Los oocitos se detienen en la segunda metafase meiótica. La ovulación es coordinada por procesos fisiológicos y bioquímicos con una participación activa de las CG. Unas pocas horas antes de la ovulación, el complejo cúmulus-oocito inicia la síntesis y ensamblaje de una matriz extracelular altamente viscosa y rica en proteínas y proteoglucanos como hialuronano, un glucosaminoglucano no sulfatado importante para la penetración del espermatozoide. Su principal componente es el  ácido hialurónico,  un gran glucosaminoglucano polianiónico grande, sintetizado por CGM y CGC y responsable de la expansión del cúmulus ooforus. El oocito  es expulsado por el folículo de De Graaf y luego fertilizado por un espermatozoide en el oviducto. No solo el oocito maduro sino también las células del cúmulus que lo rodean secretan quimioatrayentes de espermatozoides, a los cual son sensibles  los espermatozoides  humanos. Un ejemplo es la progesterona, la cual actúa como quimioatrayente de espermatozoide en concentraciones picomolares.  

   La maduración del oocito es un proceso corto y dinámico, el cual ocurre con una maduración sincrónica del núcleo y el citoplasma y muchos cambios bioquímicos. Durante la transición de folículo primario a folículo secundario maduro, regulada hormonalmente, el oocito tiene un incremento en su síntesis de ARN y acumulación de ARN y proteínas. La primera división meiótica incluye la formación del huso de metafase I y su migración a la corteza de una manera dependiente de actina con la posterior expulsión del cuerpo polar. Una dramática reorganización del sistema endomembranoso ocurre: el complejo de Golgi experimenta una sustancial reorganización entre el estadio de vesícula germinal (VG) y el estadio metafase II (MII). Durante la maduración del oocito también ocurre una reorganización del retículo endoplásmico (RE) incluyendo una remodelación del RE en los característicos “clusters” corticales. Este proceso está entre las modificaciones esenciales en el ooplasma previas a la fertilización.

   Las CG juegan un rol crucial en el soporte ambiental de los oocitos maduros. Un estudio in vitro reciente demuestra una mejor maduración de los oocitos humanos cuando son co-cultivados con  CG aisladas de oocitos maduros. En los oocitos en crecimiento hay una configuración de cromatina descondensada (nucléolos no rodeados, NNR), mientras en un oocito con crecimiento completo, antes de la maduración del oocito, la actividad transcripcional cesa y la cromatina en la VG rodea al nucléolo (nucléolo rodeado (NR) y progresivamente se vuelve condensado. Durante este período de quiescencia transcripcional las CG proporcionan nutrientes y moléculas de señalización reguladoras al oocito, y  contribuyen a la maduración nuclear y citoplasmática del oocito. Los metabolitos de glucosa (por ejemplo, piruvato), lípidos, nucleótidos y colesterol proporcionados por las CG son importantes para la transición de profase-I a vesícula germinal degradada (VGD) para pasar a metafase-I y progresar a través  de anafase-I/telofase-I a MII.

   Hay una fuerte evidencia que durante la maduración del oocito las CG secretan factores importantes al medio para el desarrollo del oocito.  Los investigadores han detectado 369  compuestos bioquímicos diferentes en las CG de los cuales 173 han sido detectados en el medio de maduración. Significativos cambios han sido descritos en el medio de maduración y las CG durante la maduración,  la mayoría de ellos relacionados con el metabolismo de aminoácidos, carbohidratos y lípidos.  En las CG se han descrito  incrementos de muchos aminoácidos (especialmente glutamina, leucina e isoleucina durante las primeras ocho horas), UDP-glucosa y UDP-galactosa (especialmente en las primeras ocho horas), lactato y piruvato (durante las 15 horas finales) y esfingomielina, glicerofosforilcolina y N-palmitoil-esfinganina. Por el contrario, se ha detectado en las CG una disminución de los niveles de betaína, taurina y oftalmate para intermediarios de rutas del metabolismo de carbohidratos (por ejemplo, fosfoenolíruvato y 3-fosfoglicerato) y para la mayoría de intermediarios en las rutas metabólicas de ácidos grasos/fosfolípidos (las más bajas para acetilcarnitina, octanoilcarnitina y carnitina). En el medio de maduración, los más importantes incrementos son para creatinina, varios aminoácidos (incluyendo hipotaurina y ornitina), urea, lactato, manitol/sorbitol, ribitol, piruvato, y para colinafosfato, mio-inositol, glicerol y carnitina.

   La interconexión comunicativa y la cooperación metabólica entre el oocito y las células del cúmulus consisten en interacciones mediadas por factores paracrinos y por uniones “gap” a través de conexina 37. Hay uniones gap homologas entre las CG y uniones heterólogas entre las CG y el oocito. Pequeñas moléculas se mueven directamente  a través de las uniones gap entre las células permitiendo el desarrollo de un acoplamiento metabólico. Un amplio  espectro de nutrientes, incluyendo sustratos energéticos, nucleótidos y aminoácidos son tomados por el oocito. Los canales de las uniones gap también tienen funciones de señalización, ellos facilitan el intercambio de compuestos de bajo peso molecular como el cAMP a través de la membrana plasmática entre el oocito y las CG y entre las mismas CG. Hay una clara evidencia en la literatura que el cAMP y otros derivados de purinas juegan un rol crucial en el mantenimiento del oocito detenido en profase de la meiosis I. El desamblaje de  uniones gap entre las CGM y las CGC resulta en un reducido aporte de sustancias al oocito provocando la ocurrencia de VGD.

   La interacción reguladora entre las CG y el oocito es bidireccional. Los oocitos humanos expresan y secretan factores que regulan la función de las CGM y las CGC, concretamente factor de crecimiento-diferenciación 9 (GDF-9) y factor de crecimiento-diferenciación 9B= proteína morfogenética de hueso 15 (BMP-15). Estas moléculas activan rutas de señalización importantes para la diferenciación de CGC. Las CGC separadas del oocito son incapaces de sintetizar ácido hialurónico y por tanto fallan en experimentar la expansión. La síntesis de ácido hialurónico por las CGC es estimulada por la hormona  estimulante del folículo (FSH).

   El crecimiento y desarrollo del oocito dependen significativamente de las interconexiones con las CG que proporcionan los sustratos energéticos a través de las uniones gap. Los dos tipos de células muestran preferencias diferentes por los sustratos energéticos para producir ATP. Las CG dependen más de la glucólisis, mientras los oocitos dependen de la fosforilación oxidativa mitocondrial. La proliferación de CG depende de la regulación al alza de la ruta factor inducido por hipoxia-1α (HIF1α)- factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)-Akt y la activación de la glucólisis. La importancia de la interconexión mutua de estas células es enfatizada por el hecho que las CG proporcionan al oocito intermediarios producidos en la ruta glucolítica (por ejemplo, piruvato y lactato). Varios estudios demuestran que el número de CG que rodean al oocito juegan un rol importante (y positivo) en su estatus energético (nivel de ATP). Las mitocondrias son esenciales para el desarrollo normal y la viabilidad de los oocitos, un número bajo está asociado con un significativo impacto negativo.

   El envejecimiento tiene un efecto bien descrito sobre la cantidad y la calidad mitocondriales. La calidad del oocito disminuye con la edad materna y el deterioro mitocondrial asociado con la edad está relacionado con esta disminución de la calidad del oocito. Varios estudios describen una reducción en el número de copias de ADN mitocondrial, disminución en el contenido de ATP e incremento en los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en oocitos de varias especies animales. Más aún, los altos niveles de ROS y SIRT1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1) en oocitos de bovino envejecida restringen la adecuada activación del sistema de control de calidad mitocondrial y pueden causar disminución de la calidad del oocito asociada con la edad.

   Una apropiada coordinación de los procesos metabólicos es crucial para la correcta maduración de los oocitos. Los niveles de ATP y la expresión de genes de proteínas claves de la cadena transportadora de electrones (CTE) fluctúan durante el proceso de maduración en los oocitos, con niveles altos de ATP en los  estadios VGD y MII temprana.  Las uniones gap entre CGC y oocito están abiertas en el comienzo de la maduración del oocito, mientras en los estadios más tardíos se cierran reduciendo la importancia de las interconexiones mutuas y el paso de sustratos al oocito. La expresión de genes asociados con la glucólisis en las CG y genes asociados con la CTE en los oocitos aumenta durante los estadios finales de la maduración. Estos hallazgos explican porque la disfunción mitocondrial afecta diferencialmente el contenido de ATP en los oocitos dependiendo del estadio de su maduración.

   El oxígeno es el nutriente más importante y esencial para el crecimiento celular y el metabolismo energético, y el número de CG y su metabolismo determinan la concentración de oxígeno folicular. Los niveles de oxígeno en el líquido folicular humano aumentan rápidamente durante los estadios antrales tempranos del crecimiento folicular, luego disminuyen a niveles bajos en las fases antral tardía y pre-ovulatoria. La hipoxia activa la glucólisis y el análisis de genes revela que los genes asociados con el HIF-1α son regulados al alza en las CG durante el desarrollo normal del folículo. El HIF-1α es el  regulador clave de la glucólisis y la fosforilación oxidativa  en CG y oocitos.

   Las mitocondrias de las células germinales femeninas experimentan cambios importantes durante la oogénesis, maduración y fertilización. Ellas muestran dinámicos cambios morfológicos a medida que aumentan en número y al mismo tiempo desarrollan complejas relaciones con otros organelos celulares (por ejemplo, retículo endoplásmico liso y vesículas) de acuerdo con las necesidades metabólicas y energéticas de la célula. El principal rol de las mitocondrias es proporcionar moléculas de ATP a través del metabolismo de carbohidratos y lípidos presentes en el citoplasma celular y el medio. El embrión genera una gran cantidad de lactato durante cultivos in vitro con una intensidad muy baja de oxidación de glucosa, solamente 10%  de la utilización total de glucosa. Estos datos pueden indicar que la actividad metabólica mitocondrial es baja durante el desarrollo temprano del embrión, un metabolismo restringido a la utilización de glucosa vía glucólisis, o una competencia por otros sustratos oxidables (glutamina, piruvato) presentes en el medio de cultivo.

   La glucosa es tomada por las CG a través de transportadores GLUT y convertida en piruvato, el cual puede ser transferido directamente al oocito a través  de las uniones gap, o secretado por las CG en el  medio que rodea al oocito. Las observaciones demuestran que la maduración del oocito es posible en un medio que contiene glucosa pero solamente en presencia de CG que producen piruvato u oxaloacetato. Por otra parte, hay estudios que describen la presencia en el oocito de hexoquinasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, enzimas de la ruta de pentosas fosfato, así como también transportadores GLUT, lo cual sugiere un posible papel del metabolismo de la glucosa en algunas funciones del oocito. El piruvato transferido por las CG y los ácidos grasos son las fuentes más importantes de sustratos para la producción de ATP en las mitocondrias del oocito en maduración. Los oocitos son ricos en transportadores de ácido monocarboxílico (MCT) que son capaces de transportar lactato.

   Los lípidos son importantes en términos de producción de energía durante la maduración del oocito y el establecimiento de un oocito competente. En las CG se han encontrado gotas de lípidos y la β-oxidación es predominante en ellas. La oxidación de ácidos grasos en las CG aumenta en el complejo cúmulus-oocito. In vitro, la suplemetacion del medio de maduración con ácido palmítico y ácido esteárico resulta en un efecto perjudicial sobre la maduración del oocito.

   Los tipos básicos de inhibidores/moduladores mitocondriales (desacoplador CCCP, antimicina A inhibidor del complejo III y oligomicina inhibidor de la sintetasa de ATP) tienen efectos negativos profundos sobre la producción de ATP del oocito, mientras el ácido bromopirúvico (AB) inhibidor de la glucólisis no tiene efecto negativo. Las CG muestran un resultado opuesto: el AB reduce el contenido de ATP, mientras los inhibidores mitocondriales no lo cambian. El complejo cúmulus-oocito tratado con CCCP o 18α-ácido glicirretínico (18AG) inhibidor de uniones gap, muestra una reducción de ATP en el oocito, donde el 18AG causa solo una leve reducción. Un alto número de CG es capaz de mitigar parcialmente el efecto negativo del CCCP sobre la producción de ATP en el oocito y un co-tratamiento con 18AG es capaz de abolir el efecto. Estos resultados sugieren que el oocito depende primariamente de la producción de ATP vía CTE, mientras las CG dependen principalmente de la glucólisis. Una disfunción mitocondrial, por tanto, solamente afecta el estatus energético del oocito, permitiendo a las CG actuar como un proveedor de ATP para el oocito (vía uniones gap). Entonces, el oocito depende de la autoproducción de ATP a través de las mitocondrias y del ATP proporcionado por las CG. Por otra parte, la oligomicina, inhibidor de la ATP sintetasa, causa una significativa disminución de ATP en el oocito, mientras el inhibidor de la glucólisis ácido yodoacético (inhibe a la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa),  no causa ninguna disminución.

   El rol de las ROS en los procesos fisiológicos y patológicos del cuerpo humano es bien conocido, junto con los antioxidantes juegan un rol importante en la regulación de los procesos reproductivos y la fertilidad en humanos. El desbalance oxidante/antioxidante está involucrado en el desarrollo de enfermedades reproductivas de la mujer, incluyendo síndrome de ovarios poliquisticos, endometriosis y preeclampsia. Los defectos de la CTE mitocondrial causan severas deficiencias de ATP e incrementan la generación de ROS. La sobre producción de ROS provoca, entre otras cosas, daño del ADN mitocondrial con severas consecuencias sobre la función mitocondrial. La endometriosis es un ejemplo ilustrativo de una enfermedad cuya patogénesis involucra una sobre producción de ROS. Las pacientes con endometriosis muestran  un  líquido folicular que contiene ROS, así como daños en el ADN nuclear en el oocito. La enfermedad puede resultar en disfunción mitocondrial en las CG y causar estrés oxidativo y apoptosis. Como consecuencia las CG de las mujeres con endometriosis tienen una menor producción de ATP y una reducida capacidad para proteger al oocito con un impacto negativo para la fertilidad de las pacientes. Sin embargo, las CG tienen un significativo rol protector contra el daño oxidativo causado por las ROS. Ellas tienen capacidad para proteger al oocito contra niveles bajos de H₂O₂ y *OH. El aumento de la concentración de H₂O₂  afecta dramáticamente el número de CG y esta reducción en la capacidad antioxidante hace al oocito más susceptible al daño oxidativo. 

   Las CG sintetizan glutatión (GSH), una molécula antioxidante, que protege las células del daño oxidativo y apoya el mantenimiento de la homeostasis redox. El GSH es un tripéptido tiol que se encuentra en las células de los mamíferos, donde juega roles importantes en el metabolismo redox, la destoxificación de xenobióticos y el transporte de aminoácidos. Está demostrado que el GSH es un importante factor citoplasmático del oocito. La modulación de los niveles de GSH durante la maduración del oocito y la fertilización es crucial para la descondensación de la cromatina del espermatozoide y la formación del pronúcleo masculino después de la penetración del espermatozoide en algunas especies animales. Cuando comienza la maduración del oocito aumenta el contenido de GSH en las CG. Sin embargo, la protección del oocito contra el efecto perjudicial de las ROS proporcionada por las CG tiene algunas limitaciones. Las bajas concentraciones de H₂O₂ y *OH pueden ser efectivamente destoxificados, mientras los efectos de altas concentraciones de estas u otras ROS como HCIO no pueden ser prevenidos.

El cuerpo humano está expuesto a una variedad de contaminantes ambientales (por ejemplo, contaminación del aire, aditivos en los alimentos, toxinas y radiaciones) que provocan genotoxicidad. Estos factores inducen daño a diferentes niveles, incluyendo ADN del oocito o en las CG. El líquido folicular, el más importante ambiente para un desarrollo adecuado del oocito, es también afectado negativamente por estos factores. Con el incremento del cáncer en los últimos años y el correspondiente incremento en el uso de terapia no quirúrgica (quimioterapia y radioterapia), el riesgo de insuficiencia ovárica por estos tratamientos es un problema altamente relevante. Las células en crecimiento de folículos maduros e inmaduros son el blanco inicial de una exposición de larga duración a agentes quimioterapéuticos. La muerte de células granulosas es detectable pocas horas después de la radiación. Las toxinas ambientales conocidas como disruptores endocrinos, (por ejemplo,  bisfenol A (BPA), un componente del plástico presente en el agua, el aire y los alimentos), disminuyen la viabilidad de las CG e induce su apoptosis. Asimismo, el bisfenol S (BPS) causa una insuficiencia en la formación de microtúbulos y disrupción de  la expansión de las células del cúmulus. Estos hechos tienen un impacto significativo sobre la calidad de los oocitos y por consiguiente en la reproducción humana.

   En conclusión, el crecimiento de los folículos ováricos y el desarrollo y maduración de los oocitos son altamente dependientes de –y son regulados por-  un acoplamiento metabólico y de señalización entre oocitos y CG. La comunicación bidireccional es mediada por un amplio espectro de moléculas de señalización. Esta interconexión coordinada es crucial para el manejo de sustratos energéticos, componentes estructurales y iones para el oocito maduro a través de uniones gap. Las CG y los oocitos tienen diferentes preferencias por los sustratos energéticos, las CG son más glucolíticas, mientras los oocitos dependen más de la ruta de la fosforilación oxidativa. Al mismo tiempo, los oocitos reciben intermediarios producidos en la glucólisis por las CG. El número de CG que rodean al oocito y su edad afectan el estatus energético del oocito. Los factores ambientales, la predisposición genética y algunos métodos terapéuticos pueden interrumpir estos procesos provocando cambios de los perfiles metabólicos y de señalización en las células que disminuyen la calidad de los oocitos, el desarrollo de enfermedades del tracto reproductivo femenino y una menor fertilidad.

Fuente: Fontana J et al (2020). Metabolic cooperation in the ovarian follicle. Physiological Research 69: 33-48.