Exosomas y homeostasis ósea

El hueso es un tejido compuesto, cuya matriz contiene  proteínas y minerales, que constantemente es modelado y remodelado a través de la coordinación de osteoclastos, osteoblastos y osteocitos. Los osteoclastos derivan de células del linaje mieloide hematopoyético mononuclear y son responsables de la resorción ósea. Los osteoblastos comprenden 4-6% del total de células residentes en el hueso y son responsables de la formación de hueso. Los osteocitos, las células más abundantes en el hueso, derivan de los osteoblastos y están embebidos en la matriz ósea mineralizada. Los osteocitos juegan un rol crítico como sensores de la carga mecánica y regulan las funciones de osteoclastos y osteoblastos. La interacción y coordinación de estas células son importantes para el mantenimiento de la homeostasis ósea. La formación de hueso usualmente comienza con la muerte de los osteocitos. Los osteocitos apoptósicos  liberan moléculas bioactivas, las cuales inducen a los osteocitos viables a secretar el ligando del receptor activador del factor nuclear κB (RANKL), el cual es importante para la diferenciación de los osteoclastos. Seguidamente, los precursores de los osteoclastos son reclutados por quimioquinas como la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP) -1, -2 y -3. La unión del RANKL con el receptor activador del factor nuclear κB (RANK) en la superficie de los monocitos inicia la osteoclastogénesis. Los osteoblastos, por su parte,  producen moléculas bioactivas incluyendo al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), MCP-1 y RANKL para el reclutamiento y diferenciación de los precursores de los osteoclastos. Mientras se resorbe el hueso dañado, los osteoclastos espontáneamente secretan “factores de acoplamiento”, como el factor de crecimiento similar a insulina (IGF) I y II y el factor de crecimiento transformante (TGF) β, los cuales son mediadores del relleno de la laguna de resorción por parte de los osteoblastos. La formación de hueso se completa cuando la nueva matriz ósea extracelular-mineralizada reemplaza completamente a la matriz ósea resorbida.

   Los exosomas, las microvesículas y los autofagosomas son tres vesículas extracelulares (VE) identificadas recientemente. La historia de los exosomas  comienza en 1877 cuando se detectaron por primera vez  partículas derivas del suero. En 1939 se demostró que la principal masa de esas partículas son los lípidos. La función de los componentes de las vesículas celulares permaneció desconocida hasta 1969 cuando el hallazgo de cristales en la matriz ósea sugirió la participación de vesículas de matriz derivadas de cartílago en la calcificación. Cinco años más tarde, en 1974, las microvesículas fueron detectadas en suero fetal  de carnero, última clase de VE  detectada antes que fueron definidos los exosomas.  En 1981, el término exosoma fue usado por primera vez para describir partículas entre 50 y 1000 nm. En 1983, se demostró que los exosomas derivados de  reticulocitos podían fusionarse con la membrana plasmática y liberar su contenido por exocitosis. En 1985, el uso de microscopía electrónica proporcionó evidencia de la externalización de los exosomas. En 1987 se describió la formación de exosomas y por primera vez se mencionan las vesículas intracelulares de endosomas multivesiculares (EMV). El análisis de las características de los exosomas se desarrolló rápidamente en la primera década posterior a la definición de exosoma. Sin embargo, la función de los exosomas permaneció desconocida por mucho tiempo.  Un avance notable en la investigación sobre los exosomas tuvo lugar en 1996 cuando  exosomas enriquecidos con péptidos del complejo mayor de histocompatibilidad (MCH) tipo II liberados por células B fueron detectados en células T. Este hallazgo describió por primera vez el rol del exosoma en la comunicación célula-célula. Sobre la base de este dato, fueron investigados sucesivamente  exosomas derivados de células dendríticas (CD) y exosomas derivados de tumor. Estos dos estudios demostraron las interacciones entre CD y células tumorales. Los exosomas derivados de CD pueden suprimir el crecimiento de los tumores y los exosomas derivados de tumor que contienen antígenos de rechazo de tumor pueden ser transportados por CD para la protección contra los tumores. En los últimos años, la investigación sobre exosomas se ha acelerado, especialmente en estudios sobre la función de los exosomas. Actualmente, los exosomas constituyen el grupo  de vesículas secretadas por membrana más claramente definido, característicamente contienen ácidos nucleicos y proteínas para señalización celular. Fisiológicamente, los exosomas son críticos para la función del sistema inmune relacionada con las respuestas estimuladora y tolerogénica. Los exosomas también están involucrados en la reparación y regeneración del tejido dañado. Más aún, también están involucrados en la regulación de mediadores inflamatorios. En conclusión, los exosomas son reguladores claves de varias funciones celulares y fisiológicas.

   Los exosomas derivados del hueso son considerados esenciales para la comunicación entre las células óseas. La transferencia de ácidos nucleicos y proteínas mediada por exosomas juega un rol vital en la regulación de la homeostasis ósea. La historia de los exosomas derivados del hueso es relativamente reciente. En 1975, partículas extracelulares de membrana fueron reportadas por primera vez en la médula ósea con una posible relación entre  vesículas extracelulares derivadas de mieloma múltiple y daño de tejido óseo. En 1979, VE derivadas del hueso normal fueron detectadas por microscopia. En 1980, los investigadores propusieron que las vesículas derivadas de osteoblastos servían como sitio inicial de calcificación.  En 2013, se demostró que los precursores de los osteoclastos liberan exosomas. Este hallazgo fue el inicio de las investigaciones sobre exosomas de otras células óseas. En 2016, fueron demostradas las características y actividades reguladoras de los exosomas derivados de osteoclastos. En 2017, fue reportada la  existencia de  exosomas derivados de osteocitos. Actualmente, los datos de las investigaciones sobre  exosomas derivados del hueso han proporcionado los detalles de las interacciones célula-célula en el hueso.

   La función y las características biológicas de los exosomas son determinadas por sus contenidos específicos. Entre los componentes de los exosomas, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos son las tres principales moléculas que determinan la especificidad de los exosomas que los distingue de las otras VE. Los lípidos son los principales componentes del esqueleto del exosoma y están involucrados en la biogénesis de exosomas. Varios lípidos de los exosomas han sido investigados en los últimos años. En un estudio de exosomas derivados de células cancerosas se identificaron más de 520 lípidos de 36 clases diferentes. Los lípidos generalmente son enriquecidos  en la membrana de los exosomas. Los principales lípidos no polares en la membrana plasmática son los esteroles, los cuales son enriquecidos en los cuerpos multivesiculares (CMV). Los esfingolípidos también son importantes para la construcción de la membrana de los exosomas, con la esfingomielina como el componente dominante. Entre los fosfolípidos de la membrana de los exosomas, la fosfatidilserina es muy importante por su papel de activadora de cargas negativas y reclutadora de proteínas de señalización. Los lípidos, además de contribuir a la composición de la bicapa de la membrana de los exosomas, tiene roles importantes en el tráfico de exosomas. Durante la formación de exosomas, el enriquecimiento con esfingomielina se lleva  a cabo en las balsas  lipídicas de la membrana. Como resultado del incremento de esfingomielina ocurre una regulación a la baja de ceramidas y diacilglicerol hasta alcanzar una proporción balanceada en el exosoma.  Aunque los lípidos no son los principales participantes de la comunicación entre las células óseas, sus roles en el mantenimiento de las características biológicas de los exosomas son de gran importancia.

   A través del análisis proteómico, proteínas componentes del citoesqueleto (tubulina, actina, cofilina, profilina), anexinas (anexina I, II, IV, V y VII), y los miembros de la familia de proteínas G, rab 7 y rab 11  han sido identificadas en los exosomas de mamíferos. Entre todas estas proteínas, las proteínas enriquecidas en el citoplasma como Alix, TSG 101, tetraspaninas como CD9 y CD63 son los marcadores que distinguen a los exosomas de otras partículas extracelulares. Los estudios recientes sugieren que las proteínas de shock térmico (Hsp) son altamente prevalentes en los exosomas. Entre ellas, la Hsp40 puede mejorar el ambiente para el plegamiento de proteínas y la Hsp70 regula al alza citoquinas pro-inflamatorias. Además de las proteínas ya mencionadas, hay otras que reflejan la especificidad del origen celular y las funciones de los exosomas. Por ejemplo, la proteína latente de membrana 1 (LAMP1) es altamente expresada por exosomas liberados por células epiteliales malignas derivadas de cáncer nasofaríngeo. Asimismo, un proteoglucano específico de la superficie celular, glipican-1 (GPC1), es expresado en exosomas derivados de cáncer pancreático.

   Los ácidos nucleicos también son enriquecidos en los exosomas. ARN codificantes y no codificantes, ADN de una banda y de doble banda se encuentran en los exosomas. En los exosomas derivados de células de mamíferos se han detectado más de 1600 mARN y 700 miARN. Los mARN presentes en los exosomas usualmente están relacionados con la citogénesis, la síntesis de proteínas y la modificación posttranscripcional del ARN. Los mARN de los exosomas también están involucrados en la resistencia a las drogas de los tumores. Otro reporte reciente sugiere que los mARN de los exosomas disparan la expresión de proteínas exógenas, esto puede ser un enfoque novedoso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con deficiencia genética  de proteínas.   Los exosomas también contienen abundantes miARN. En el sistema inmune, los exosomas enriquecidos con miARN son liberados por linfocitos T, linfocitos B y CD, y están involucrados en la interacción entre linfocitos T y células presentadoras de antígenos. En varios tumores, los miARN de los exosomas participan en el crecimiento del tumor, las metástasis y la resistencia a las drogas. Por otra parte, la evidencia sugiere que los ADN de los exosomas protegen contra el envejecimiento celular y la muerte celular causada por daño en el ADN.  Las células pueden secretar exosomas y trasladar el ADN dañino a la matriz extracelular. 

   El tráfico de exosomas involucra tres mecanismos: salida de la carga, liberación del exosoma y captación  del exosoma. Durante la generación de exosomas, la maquinaria endosomal, el estadio inicial de los exosomas, es formada a través  de invaginaciones en la célula donadora. La incorporación  de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos en el endosoma resulta en la formación de EMV. Seguidamente, los EMV se fusionan con la membrana celular provocando la secreción del exosoma. A continuación, la proteína unida a la superficie activa la captación del exosoma en la célula recipiente.  Finalmente, a medida que progresa la endocitosis, el exosoma libera su contenido que puede influir en los procesos reguladores o ser degradados por los lisosomas. La incorporación de proteínas en el exosoma involucra mecanismos que aseguran la especificidad del exosoma en la comunicación intracelular. Aquí, el sistema ESCRT, constituido por cuatro complejos (ESCRT 0, I, II y III) es el principal mecanismo para la formación de exosomas. ESCRT 0, I y II son responsables de reconocer y secuestrar proteínas de la membrana celular  en la membrana del endosoma y ESCRT III es responsable de la reparación de vesículas intraluminales. La incorporación de proteínas independiente de ESCRT es otra ruta importante para la formación de exosomas. Este proceso requiere la formación de una plataforma de membrana asociada a tetraspaninas donde las proteínas citoplasmáticas y transmembrana ejercen su capacidad para aceptar proteínas específicas. La incorporación de ácidos nucleicos sigue un mecanismo diferente. La carga de ARN en el exosoma  comienza con la formación de una región similar a la balsa lipídica. A continuación, los fosfolípidos aniónicos son enriquecidos en esa región del exosoma y reclutan esfingomielinasa 2 para producir moléculas de ceramida, un factor indispensable para la incorporación de ARN. Una vez unido a la región similar a la balsa lipídica, el ARN es encapsulado en una vesícula y liberado al espacio extracelular en esta vesícula.

   La mayor diferencia en la ruta de exocitosis entre exosomas y otras VE (autofagosomas y microvesículas) es que los exosomas dependen de los endosomas tardíos para su liberación, y la fusión de los CMV (endosomas tardíos) con la membrana plasmática es la última etapa antes de la secreción de exosomas a la matriz extracelular. Durante esta fase las proteínas SNARE y miembros de la familia sinaptotagmina son los principales mediadores. La exocitosis de exosomas requiere complejos SNARE que consisten de sintaxina 7, sinaptotagmina 7 y VAMP 7. El complejo SNARE es activado por la regulación al alza del calcio intercelular, el cual es dependiente de proteínas Rab. A continuación, las proteínas SNARE promueven la aposición de vesículas y membranas celulares. Después de este acoplamiento, la chaperona factor sensible a ATPasa N-etilmaleimida (NSF) y las proteínas de adhesión NSF solubles (SNAP) catalizan la desintegración de los complejos SNARE, provocando la liberación de exosomas. Otro factor clave para la liberación de exosomas involucra a las proteínas Rab, una familia de más de 60 miembros que participan en las interacciones del citoesqueleto. Las proteínas Rab 27A y  27B participan en la interacción de los CMV con la membrana plasmática. Estas proteínas participan en la eventual fusión de las membranas de los exosomas y el plasmalema de las células donadoras que resulta en la exocitosis de exosomas.

   La fusión de exosomas con la célula recipiente requiere la interacción de ligandos vesiculares con receptores celulares como tetraspanina, integrinas y moléculas de adhesión inetrcelular (ICAM), las cuales inducen la unión del exosoma a la superficie de la célula blanco. El reconocimiento de las proteínas de superficie es la primera etapa durante la internalización del exosoma. La evidencia acumulada sugiere que la captación de exosomas es altamente dependiente del estatus de señalización de la célula blanco y de las proteínas de la superficie del exosoma. Durante la internalización del exosoma, participan varias rutas incluyendo endocitosis, fagocitosis, micropinocitosis y fusión de membranas. Entre ellas,  la ruta  más común para la captación de exosomas es la endocitosis, un proceso rápido que ocurre en 15 minutos y depende de la participación de caveolina y clatrina. Los exosomas también  pueden fusionar directamente su membrana con la membrana plasmática de la célula recipiente. Esto depende de dos etapas intermedias: la hemifusión de estructuras  y la fusión de poros. El contacto inmediato de las hojuelas de la bicapa provoca la formación del tallo de hemifusión donde las hojuelas se fusionan. Finalmente, la fusión de poros se  abre en el diagrama de hemifusión dependiendo de la expansión del tallo donde la conexión entre las membranas provoca la liberación.

   Los estudios recientes sugieren que la transferencia de proteínas específicas, mARN y miARN es el principal mecanismo para el remodelado óseo mediado por exosomas. El remodelado óseo es un proceso complejo, el cual está asociado principalmente con dos etapas: osteogénesis y osteoclastogénesis. Los exosomas están involucrados en las dos etapas. Durante el proceso de formación de hueso, los exosomas están involucrados en la diferenciación osteogénica de stem cells mesenquimales (MSC). Los exosomas derivados de monocitos son estimuladores de la diferenciación de osteoblastos. La fusión de estos exosomas con las MSC puede disparar la regulación al alza de dos marcadores osteogénicos: RUNX2 y BMP-2. La osteogénesis también depende de la función de los exosomas. Los precursores de osteoblastos, antes de la diferenciación en osteoblastos, secretan exosomas para promover la osteogénesis. Durante la cicatrización de las fracturas ósea, los exosomas derivados de stem cells de la médula ósea expresan MCP-1, MCP-3, SDF-1, factores angiogénicos, mARN, miARN que cooperativamente contribuyen al remodelado óseo. Estos exosomas también aumentan la proliferación y diferenciación de osteoblastos regulando al alza proteínas relacionadas con la osteogénesis (RUNX2, ALP, OCN y OPN) así como también varios genes (miARN-196a, miARN-27a y miARN-206). Los exosomas derivados de osteoblastos y osteoclastos también están involucrados en la osteogenesis. Los osteoblastos pueden secretar exosomas ricos en Let-7 para aumentar la osteogénesis. Por el contrario, los exosomas derivados de osteoclastos actúan como inhibidores de la osteogénesis. La transferencia exosomal de miARN 214-3p de los osteoclastos a los osteoblastos dispara la reducción de masa ósea en ratones.   

   La osteoclastogénesis es la base para la resorción ósea.  Los estudios recientes sugieren un nuevo mecanismo para la osteoclastogénesis. Inicialmente, los osteoblastos secretan exosomas ricos en RANKL que tienen como blanco los monocitos. La unión RANKL-RANK en la superficie de los monocitos activa la osteoclastogénesis. Este proceso puede ser aumentado por exosomas derivados de MSC que regulan al alza la expresión de Nfatc1, Trap y Ctsk. Mientras se inicia la diferenciación de los osteoclastos, también se inicia el mecanismo que controla el número de osteoclastos. Esto puede ser mediado por exosomas derivados de los osteoclastos o de los osteoblastos. Los osteoclastos recién formados liberan exosomas ricos en RANK que puede unirse directamente con el RANKL de los osteoblastos o competitivamente con el RANKL en la matriz extracelular para regular la formación de osteoclastos. Adicionalmente, los osteoblastos pueden liberar exosomas que contienen miARN-503-3p para inhibir la osteoclastogénesis a través de la inactivación de la señal RANKL-RANK. Alternativamente, los monocitos pueden secretar exosomas para promover la diferenciación de los osteoclastos. El resultado final es que los osteoclastos son rápidamente reclutados durante esta fase aun cuando los exosomas que inhiben la osteoclastogénesis sean liberados constantemente. Durante la resorción ósea, la capacidad de los osteoclastos para resorber hueso puede ser afectada por los exosomas. Por ejemplo, (i) exosomas derivados de suero de pacientes osteoporóticos, osteopénicos o viejos aumentan la resorción ósea; (ii) cuando la resorción ósea está cerca de su finalización, los exosomas ricos en RANK derivados de osteoclastos impiden la osteoclastogénesis; (iii) los exosomas ricos en RANKL que son secretados por osteoblastos pueden inhibir la resorción a través de la inducción de la apoptosis de osteoclastos.

   Los osteocitos también tienen la capacidad para liberar exosomas, los cuales  están involucrados en la homeostasis ósea. Los exosomas derivados de los osteocitos pueden regular la diferenciación de osteoblastos a través del miARN-218 que actúa sobre la ruta de señalización Wnt/β-catenina. La ruta Wnt/β-catenina es orquestada por osteocitos y es de gran importancia en la homeostasis ósea tanto en la formación de hueso como en la resorción ósea. La esclerostina y la DKK1 inhiben la ruta Wnt/β-catenina uniéndose a los co-receptores de Wnt, LRP5/6 y por tanto contribuyen a la pérdida ósea. Los exosomas que contienen miARN-218 derivados de osteocitos también pueden inhibir la ruta Wnt/β-catenina. Estos exosomas son aceptados por los osteoblastos y provocan la regulación al alza de esclerostina, DKK1  y RANKL. Por otra parte, los osteocitos pueden liberar exosomas en respuesta a la carga mecánica. Inicialmente, la estimulación mecánica dispara la contracción inmediata de la red de actina, lo cual resulta en un incremento transitorio de Ca²⁺. Simultáneamente, la estimulación mecánica induce la secreción de exosomas por los osteocitos. Este proceso puede ser aumentado por la regulación al alza de Ca²⁺ intracelular. Finalmente, los exosomas liberados por osteocitos que contienen esclerostina, RANKL y osteoprotegerina actúan sobre los osteoblastos para activar la osteogénesis.

   En conclusión, los exosomas son un grupo heterogéneo de estructuras membranosas que median las interacciones entre las células. Los estudios recientes revelan una relación entre exosomas y homeostasis ósea. Las células óseas secretan exosomas que contienen  proteínas, lípidos y ácidos nucleicos y regulan la osteoclastogénesis y la osteogénesis. Los exosomas derivados del hueso tienen una función reguladora sobre cada tipo de célula ósea. Los exosomas derivados de osteoblastos aumentan la osteogénesis. Los precursores de osteoclastos conjuntamente con los exosomas derivados de osteoblastos promueven la osteoclastogénesis. Los exosomas derivados de MSC son una poderosa herramienta en el remodelado óseo a través del aumento de la proliferación celular y la protección contra la muerte celular.

Fuente: Gao M et al (2018). Exosomes-the enigmatic regulators of bone homeostasis. Bone Research 6: 36.