MicroARN y secreción de insulina

Los micro ARN (miARN) son compuestos endógenos, producto de una compleja vía de procesamiento,   formados por pequeñas moléculas de ARN de cadena simple (20-24 nucleótidos) que se unen específicamente  a la región no traducida  del extremo 3´ de los ARN mensajeros (ARNm) e inducen  su degradación o bloquean  su traducción. Descubiertos en C elegans, hasta la fecha se han identificado  cientos de miARN en animales, plantas y virus.    Los miARN  son sintetizados y madurados  a través de una maquinaria enzimática que involucra a las endonucleasas  Drosha y  Dicer. Estas dos enzimas  juegan roles complementarios  en la maduración  del miARN. Inicialmente un miARN  se encuentra en un transcripto primario de gran longitud. La secuencia  del miARN está contenida  dentro de una estructura tipo horquilla   de 60 a 80 nucleótidos  que es clivada por acción de la M7G endonucleasa Drosha dando lugar a un producto intermedio conocido como pre-miARN.  El pre-miARN es transportado al citoplasma por medio de la  proteína exportina 5 donde es procesado por acción de la endonucleasa Dicer. Como resultado del clivaje  se produce una estructura  de doble cadena. Una de las cadenas  es cargada selectivamente  en el complejo de silenciamiento y sirve de guía  al complejo hacia el ARNm induciendo su clivaje y degradación si la complementariedad  es perfecta o la represión de la traducción  si la complementariedad es imperfecta. La función específica de la DICER en el estadio final  de la biogénesis  de miARN hace que su inactivación sea un blanco importante en el estudio del rol biológico global de los miARN a nivel del organismo y a nivel de órgano. Los miARN pueden ser codificados por genes específicos  así como por intrones  de los genes que codifican proteínas  a través de promotores independientes y a menudo modulan los mismos mecanismos  biológicos  de la proteína codificada  por el gen huésped. Los miARN regulan la  expresión de genes  a través del deterioro de  ARNm y represión translacional. Ellos son incorporados  en complejos silentes  inducidos por  ARN con proteínas  Argonaute que tienen actividad ARNasa H y pueden  clivar a los ARNm blancos interactuantes.

Típicamente, un miARN puede  tener como blancos varios ARNm y un transcripto puede ser blanco de varios miARN. Este proceso resulta  en una mayor complejidad  de la regulación  transcripcional  de redes de genes y rutas de señalización. Sin embargo, la unión de un miARN a sus ARNm blancos  puede llegar a efectos biológicos solamente si el miARN y los ARN blancos están presentes simultáneamente en la misma célula  de un tejido en un momento dado.  Si los miARN son sintetizados  localmente o transportados  a las células de un tejido, sus funciones biológicas dependen esencialmente  de la expresión de los patrones tejido-específicos de ARNm  presentes en el tejido  en un momento dado y en condiciones biológicas específicas.  La evidencia  acumulada  sugiere roles cruciales  de los miARN en la regulación del metabolismo, la diferenciación de los adipocitos, el desarrollo pancreático y la biosíntesis, secreción y señalización  de insulina.

El impacto global de los miARN sobre el desarrollo del páncreas  quedó en evidencia  en embriones de ratones sin DICER específica de páncreas, los cuales presentaron un incremento de la apoptosis  que resultó en una dramática  pérdida (79-95%) en todos los tipos de células endocrinas con un efecto predominante sobre las  células β y la muerte de la cría inmediatamente después del nacimiento. Sin embargo, cuando la DICER es inactivada en células β de ratones adultos, la arquitectura de los islotes y los marcadores de diferenciación  se mantienen sin cambios, pero el contenido de insulina, los niveles de ARNm de insulina y la secreción de insulina inducida por glucosa disminuyen, provocando hiperglucemia e intolerancia a la glucosa.  Adicional  al rol global de la  DICER, los miARN individuales contribuyen a la regulación  del desarrollo  del páncreas endocrino y la función de las células β. En este contexto, la investigación sobre miARN ha proporcionado  evidencia del rol central  del miR-375, el cual es expresado específicamente en los islotes pancreáticos. El miR-375 regula la proliferación de células β y la secreción de insulina a través de un efecto  sobre la exocitosis  de insulina, la cual involucra  proteínas codificadas por blancos del miR-375, incluyendo la miotrofina (MTPN) y la proteína quinasa dependiente de fosfoinositido 1 (PDK1). El miR-375  también es expresado  en las células α pancreáticas y juega un importante rol  en la organogénesis  del páncreas. La inactivación del miR-375 en ratones está asociada con disminución de la masa de células β, incremento en el número de células α y los niveles plasmáticos de glucagón, hiperglucemia, disminución de la secreción de insulina y alteración de la arquitectura  de los islotes. El miR-483 exhibe patrones similares  de regulación  de la secreción de insulina y glucagón. Otros miARN  afectan selectivamente  el desarrollo de los islotes, los MiR-7 y miR-199b-5p regulan la proliferación  de células β, el miR-124a, expresado durante la organogénesis del páncreas, tiene como blanco  factores de transcripción (FOXA2, PDX1) involucrados en la diferenciación de células β. Los miR-124a y miR33a, potentes reguladores del metabolismo  del colesterol en el hígado, inhiben la liberación de insulina.  Los miR-9 y miR-96  regulan la liberación de insulina  a través de la RabGTPasa granufilina, un componente de los gránulos secretores en las células β.  La proteína desacetilasa SIRT1 puede mediar los efectos del miR-9 sobre la secreción de insulina y el miR-29 puede regular la liberación de insulina en islotes de ratón  a través del transportador de  monocarboxilato  SLC16A1 en la membrana plasmática, lo cual asegura el acoplamiento entre el metabolismo de glucosa y la secreción de insulina. 

La expresión de miARN en las células β está directa o indirectamente relacionada con factores de transcripción (PDX1, FOXA2, ONECUT2, HNF6, NGN3, NEURODI), los cuales juegan un rol crucial en las células β.  Los estudios transcripcionales  de miR-26, MiR182, miR-148 y miR200/141 indican que estos miARN pueden estimular la transcripción  del gen de insulina, un fenómeno que podría ser mediado por represores transcripcionales  (BHLHE22, SOX6) del gen de insulina. Aunque la evidencia apoya  los importantes roles  de los miARN en el desarrollo del páncreas endocrino y la diferenciación y función de las células β, el hecho  que en estos procesos sean requeridos factores de transcripción  que  son blancos de miARN  sugiere fuertes efectos temporales  de los miARN en la organogénesis  del páncreas endocrino.

La regulación de la expresión de miARN mediada por DICER juega un rol clave  en la biología del tejido adiposo. El efecto de la restricción calórica sobre la regulación hacia abajo dependiente de la edad de DICER y miARN ha sido demostrado en ratones, el tejido adiposo “Knockout” DICER de ratones  está asociado con una mayor sensibilidad al estrés oxidativo. Los estudios  de la expresión de miARN en tejido adiposo en modelos animales y pacientes obesos han proporcionado información sobre los miARN que son diferencialmente expresados  en la obesidad, incluyendo miARN (miR-27a, miR-103, miR-107) expresados en  modelos de roedores  y los miARN  (miR-15a, miR-30d) que son expresados en modelos de roedores y humanos. Adicionalmente, la expresión de miR-125a  es regulada hacia abajo en el tejido adiposo subcutáneo de pacientes obesos de acuerdo con su estatus diabético. Estos datos se correlacionan  con marcadores de obesidad (masa grasa, niveles circulantes de leptina, adiponectina y triglicéridos). Por otra parte, los factores de transcripción y coactivadores (PPARG, PGC1A, PGC1B, C/EBP, KLF, SREBP) que juegan roles claves  en la adipogénesis son controlados por miARN. Este efecto es parcialmente explicado  por la represión  de genes que codifican  a la carnitina O-acetiltransferasa (CRAT), una enzima que controla el metabolismo  de ácidos grasos y la MED13, involucrada  en un complejo coactivador transcripcional requerida para la expresión de genes.

Los miARN, además de su rol  en la diferenciación  y maduración  de adipocitos,  también afectan la resistencia  a la insulina.  En humanos, el miR-143 regula la diferenciación de pre-adipocitos en adipocitos a través  de la proteína quinasa activada por mitogenos MAPK7 (ERK5) que pertenece a una familia de proteínas  involucradas en la proliferación y diferenciación celular. El miR-143 también regula la sensibilidad a la insulina  en ratones obesos  a través de la activación  de la AKT, la cual es requerida  para el transporte de glucosa estimulado por insulina.  La expresión  de miR-133a y miR-133b se correlaciona negativamente  con la expresión de PRDM16, UCP1, PPARG y PPARA  y regula la diferenciación  de tejido adiposo marrón, específicamente a nivel subcutáneo. La inflamación es una  de las anomalías características de la obesidad y el rol de los miARN en la respuesta inflamatoria ha sido reportado en varios estudios. Entre los miARN asociados con inflamación, el miR-155  es sobreexpresado  en el tejido adiposo de pacientes obesos y su expresión es estimulada por leptina, resistina, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e IL-6 en adipocitos humanos.  Las investigaciones sobre la expresión de  miR-132 en preadipocitos y adipocitos diferenciados humanos sugieren una relación entre la sobre expresión  de miR-132 y la inducción  de la traslocación  de factor nuclear  kappa B (NF-κB), la acetilación de p65 y la producción  de IL-8 y proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1). Estos efectos pueden  ser explicados por la regulación hacia abajo de la expresión de SIRT1, la cual contiene  un sitio de unión para miR-132, que resulta en la activación de rutas inflamatorias.

En comparación con otros órganos, relativamente poco se conoce de la biología  de los miARN en los músculos esqueléticos.  El análisis de la expresión  de miARN en el gastronemio  de ratones db/db identificó 41 miARN expresados diferencialmente. La regulación hacia arriba  de la expresión de miR-135a en este modelo  ha sido reproducida en pacientes diabéticos y coincide con niveles reducidos  del transcripto IRS2, un blanco validado de este miARN. El silenciamiento de miR-135a  en ratones db/db  está asociado  con una mejoría  de la tolerancia a la glucosa y un incremento en los niveles  de IRS2 y p-Akt, lo que sugiere  un rol de este miARN  en la  señalización de la insulina.  En humanos, el análisis de la expresión de miARN en músculo esquelético de pacientes diabéticos ha identificado  la expresión diferenciada de 62 miARN, incluyendo miR-106b y miR-133a.  Los datos de varios  estudios indican  que el miR- 106b regula hacia abajo la expresión de mitofusina-2 (Min2)  y contribuye a la resistencia a la insulina en los miotubos. El MiR133a es, con el MiR-1, el más abundante miARN en el músculo esquelético. La expresión  diferencial de miR-133a en músculo esquelético ha sido confirmada en humanos en respuesta  a la estimulación  con insulina.  La regulación hacia abajo inducida por insulina del miR-133a es mediada al menos parcialmente  por mecanismos que involucran  a la proteína de unión  del elemento regulador de esteroles (SREBP-1c) y un factor aumentador de miocitos (MEF2C).  Otros componentes  importantes  de la ruta de señalización  de insulina  son influenciados  por miARN específicos en músculo esquelético. Por ejemplo, el tratamiento anti-miARN en ratones alimentados con dietas ricas en grasa resulta  en un incremento de la masa muscular, lo cual ocurre  a través de la represión  de múltiples componentes   (IGF1R, INSR, IRS2) de la ruta insulina-PI3K-mTOR.

La evidencia experimental apoya el rol de los miARN en la resistencia a la insulina a través de la regulación del metabolismo del colesterol y ácidos grasos libres en el hígado.  La novel hipótesis  emergió de estudios sobre la expresión de los miARN e investigaciones sobre miARN individuales. Por ejemplo, el análisis de los ARNm blancos del miR-125a, el cual es expresado fuertemente  en la rata GK, con énfasis en la ruta de señalización MAPK, que proporcionó  datos de los mecanismos  moleculares que median los efectos del miR-125a que contribuyen a la diabetes en esta cepa de ratas.  Los  miARN  miR-29a y miR-29b son sobreexpresados en tres tejidos sensibles a insulina (hígado, músculo esquelético  y tejido adiposo) en la rata GK. Estos miARN regulan la sensibilidad a la insulina  a través de proteínas que contribuyen a la señal de insulina. En paralelo con estos estudios genómicos globales, varios miARN han sido examinados  individualmente en su función en el hígado. La atención se ha puesto particularmente en los mecanismos asociados con la alteración de la expresión  de miR-122, miR-33a, miR-33b y Let-7, los cuales ilustran aspectos específicos de la biología de los miARN.  La investigación de la expresión de miARN en el hígado en  modelos animales de obesidad  y diabetes y pacientes obesos revela la sobreexpresión sistemática de miR-143, miR-802 y miR-181a. Estos miARN tienen como blancos distintos grupos de transcriptos  con diferentes funciones, incluyendo la proteína  relacionada con la proteína ligadora de oxiesteroles 8 (blanco del miR-143), la cual  proporciona un enlace entre los mecanismos  de metabolismo energético y crecimiento y diferenciación celular mediados por la serina/treonina quinasa AKT (proteína quinasa B, PKB) y la desacetilasa  dependiente de NAD+ SIRT1 (blanco del miR-181a). Estos datos resaltan las funciones hepáticas que dependen de la regulación combinada  de la expresión de miARN y sus ARNm blancos. Los estudios in vivo e in vitro han demostrado el rol  de estos miARN  en la homeostasis del colesterol  y los lípidos a través de un efecto directo  sobre la expresión  de genes  que codifican  las proteínas que regulan el flujo de colesterol (ABCA1, ABCB11, ABCG1, ATP8B1, NPC1), el transporte de ácidos grasos  en las mitocondrias (CPT1A, CROT), la oxidación de ácidos grasos (HADHB), el metabolismo de la glucosa y la resistencia al estrés (SIRT6), la síntesis de ácidos grasos y colesterol (AMPKA1) y la señal de insulina (IRS2). Adicionalmente, la expresión alterada de estos genes mediada por el miR-33 puede tener efectos sobre la expresión de los genes  involucrados en la producción de ácidos grasos (ACC1, FASN, HMGCR, SCD1)  y la sensibilidad a la insulina (a través de la actividad de IRS2). El miR-33a puede regular hacia abajo al gen ABCA1 en los islotes pancreáticos  e incrementar la acumulación de colesterol. La expresión alterada  de miARN en el hígado puede resultar en cambios en la expresión  de genes involucrados en la regulación del metabolismo de lípidos, provocando hígado graso no alcohólico (NAFLD) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

La presencia de complejos de miARN y proteínas Argonaute en los líquidos extracelulares  representa un nuevo sistema  de comunicación célula-célula.  Los miARN, en su mayoría  producidos en tejidos vecinos, son detectados en la sangre donde pueden ser tomados en su forma activa por las células. La investigación de la expresión de más de 700 miARN en plasma de pacientes con diabetes tipo 2 identificó cambios  en la abundancia de miARN (miR-15a, miR-29b, miR-126, miR-223, miR-28-3p) que pueden predecir el inicio de la diabetes. Los cambios  en la expresión de miARN en modelos de enfermedad  pueden  ser un evento fenotipo causal o reflejar adaptaciones fenotípicas secundarias a la enfermedad. Las rutas mediadas por miARN pueden estar involucradas en enfermedades genéticas a través de mutaciones y polimorfismos que resultan en alteraciones en la maduración  de los miARN, cambios en su secuencia o modificación de la conformación  de horquilla  que podrían tener consecuencias en la expresión de un gran número de transcriptos y rutas biológicas que ellos regulan. Los polimorfismos en la secuencia de los transcriptos blancos, los cuales podrían alterar la unión  a miARN, también pueden afectar la función mediada por ARNm con impredecibles consecuencias fisiopatológicas.

En conclusión, los miARN son componentes moleculares  intracelulares y circulantes que contribuyen  al control de la expresión de genes  a través de la unión a los ARNm blancos, lo cual generalmente resulta  en la regulación hacia abajo de la expresión de ARNm. Un miARN puede tener como blanco  a varios ARNm y un transcripto puede ser blanco de varios miARN lo cual resulta en una compleja regulación  de redes de genes  y rutas de señalización. Los miARN regulan el metabolismo, la diferenciación de adipocitos, el desarrollo pancreático, la masa de células β, la biosíntesis,  secreción y señal de insulina. Asimismo,  hay evidencia de su rol en la diabetes y la obesidad. Los efectos fisiopatológicos dependen esencialmente de la co-expresión con sus ARNm blancos en la misma célula, lo que sugiere respuestas transcripcionales tejido-específicas para las condiciones de enfermedad  y los desafíos ambientales. El actual conocimiento  de la biología de los miARN y su impacto  en la patogénesis de la diabetes  y la obesidad se basa en los datos experimentales que documentan la expresión  de miARN  en tejidos simples que  puede ser correlacionada con la expresión de los ARNm blancos para integrar a los miARN en rutas  funcionales  y redes de genes.

Fuente: Calderari S et al (2017). Biological roles of microRNAs in the control of insulin secretion and action. Physiological Genomic 49: 1-10.