Relojes circadianos y cáncer de mama

La incidencia de cáncer de mama  es mucho mayor en los países desarrollados. Esto sugiere que  aspectos del estilo de vida occidental moderno pueden influir  en el inicio y la progresión  del cáncer de mama. Una posibilidad es una disrupción de los relojes internos del cuerpo, conocidos como relojes circadianos. En la mama, los relojes circadianos  regulan la expresión rítmica de numerosos genes. La disrupción  de la expresión de los genes circadianos puede alterar la biología de la mama y promover el cáncer. Los relojes circadianos intrínsecos son manejados por señales ambientales como el ciclo día/noche natural. El cuerpo humano transforma estas señales del tiempo en oscilaciones moleculares en las células individuales, las cuales manejan ritmos de 24 horas para los procesos celulares  en casi todos los tejidos del cuerpo.  Estos osciladores moleculares autónomos constituyen el sistema del tiempo interno del cuerpo y son sincronizados por un marcapaso master, el núcleo supraquiasmático (NSQ). Sin embargo, los relojes circadianos pueden ser perturbados  a través de los cambios en el horario laboral, períodos repetidos de jet lag y durante el envejecimiento. El debilitamiento o daño  de los relojes circadianos altera la susceptibilidad  a ciertas enfermedades.

Uno de los procesos regulados por los relojes circadianos es el ciclo celular. Por lo tanto, la disrupción  de los ritmos circadiano puede ser asociada  con las divisiones celulares anormales que ocurren el cáncer. Existe evidencia de una   relación entre relojes circadianos alterados y tumorigénesis en cáncer colorectal, osteosarcoma, adenocarcinoma pancreático  y, más notablemente, cáncer de mama. La influencia  del ritmo circadiano alterado  sobre el cáncer de mama  fue propuesta en los años de la década de 1960. Desde entonces, esta claro que la disrupción circadiana influye en los complejos mecanismos moleculares del cáncer de mama. La indicación  que la tumorigénesis  está relacionada  con alteraciones de los ritmos circadianos  sugiere que la manipulación  de esos ritmos puede ser importante para el tratamiento del cáncer.

El NSQ, localizado en el hipotálamo anterior, coordina los ritmos circadianos con el día solar. El bilateral NSQ recibe inervación directa de la retina  a través del tracto retinohipotalámico.  La mayoría de las aproximadamente 20000  neuronas del NSQ son “células marcapaso”,  cada neurona contiene su propia maquinaria osciladora capaz de producir  un prolongado y robusto ritmo circadiano aun en cultivo ex-vivo. La luz es un dador de tiempo sincronizante. Sin embargo, así como ocurre con el ciclo luz/oscuridad, el NSQ también responde a los cambios en el ciclo reposo/actividad. Estímulos no fóticos como señales neuroendocrinas y la conducta alimenticia también pueden influir  en la actividad del NSQ. El NSQ usa varias rutas neurales y endocrinas para sincronizar los relojes de muchos órganos periféricos. Una  de ellas es la hormona melatonina, la cual es liberada rítmicamente en la noche y transmite información  a órganos periféricos. El NSQ no es requerido  por los órganos periféricos para generar sus propios ritmos, más bien actúa como el conductor de una orquesta guiando a cada órgano  a oscilar en la fase ideal para ese tejido específico.

La regulación genética básica del reloj circadiano  está  altamente conservada en el reino animal. La mayoría de genes reloj de mamíferos fueron identificados  a través de estudios mutagénicos  en  moscas de frutas. El reloj molecular  genera oscilaciones en los niveles de proteínas  a través de una serie  asas de retroalimentación transcripcional/translacional auto-reguladas. Varios genes reloj codifican factores de transcripción, con el reloj molecular  manejando la expresión rítmica  de genes controlados hacia abajo. Los principales componentes involucrados  en esta red reloj celular  incluye a los activadores transcripcionales CLOCK (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput)  y BMAL1 (Brain and Muscle Arnt-like protein-1). El CLOCK tiene un paralogo, NPAS2 (Neuronal PAS domain protein 2), el cual compensa la pérdida  de CLOCK en  NSQ y osciladores periféricos.  Los otros componentes son: Periodo (PER1 y PER2) y Criptocromo (CRY1 y  CRY2), los cuales forman el brazo negativo del asa de retroalimentación. Adicionalmente,  se han identificado otros sistemas reguladores que incluyen  receptores  nucleares de hormonas y mecanismos epigenéticos.  La expresión de genes circadianos es el resultado  de una serie de eventos de transcripción y translación. Esto provoca la expresión de un grupo de proteínas que los apaga al final del día. Luego, con la remoción  de los represores (PER y CRY), comienza nuevamente el proceso.

Los ritmos celulares de 24 horas son manejados por un asa de retroalimentación autoregulada. Durante el día subjetivo, el receptor orfan relacionado con  ácido retinoico α (RORα) contribuye a la expresión de Bmal1 a través de su elemento de respuesta (RRE), lo cual provoca la formación de heterodímeros CLOCK/BMAL1. Este complejo se une a secuencias CACGTG E-box en los promotores de los genes Per y Cry, incrementando la expresión de estos reguladores negativos. El complejo CLOCK/BMAL1 también incrementa la expresión de REV-ERBα, el cual suprime la transcripción de Bmal1. Por la tarde se acumulan los niveles de PER y CRY para formar un complejo proteínico, el cual se vuelve activo como un inhibidor de CLOCK/BMAL1. El incremento en la expresión  de Per y Cry mediado por CLOCK/BMAL1 permite la acumulación  de PER en el citosol, donde es fosforilada por la caseína kinasa 1ε y 1δ. La PER fosforilada es ubiquitinizada y rápidamente degradada, pero la acumulación de CRY permite la formación  de un complejo PER/CRY/CK1 estable. Este complejo inhibe la capacidad transcripcional de CLOCK/BMAL1 previniendo una mayor expresión de Per y Cry y también de REV-ERBα. Eventualmente, PER y CRY fosforiladas se pierden, desreprimiendo la transcripción de Bmal1 y permitiendo que los altos niveles de BMAL1 inicien el próximo día circadiano. Durante la noche subjetiva, REV-ERBα suprime la expresión de Bmal1, mientras el complejo PER/CRY formado nuevamente bloquea la actividad CLOCK/BMAL1 previniendo la transcripción de los genes Per y Cry. Durante este tiempo el complejo PER/CRY fosforilado se degrada gradualmente. Colectivamente estos ciclos aseguran que el reloj circadiano oscile con un periodo de 24 horas,  manejado por la señal de tiempo ambiental apropiada.

Los tejidos periféricos tienen su propias oscilaciones circadianas intrínsecas y auto-sostenidas, pero dependen  del reloj central y de factores tisulares específicos para la sincronización.  Los osciladores celulares locales regulan programas circadianos específicos de expresión de genes que varían de acuerdo   a la función tisular, 5-10%  de todos los genes son transcritos rítmicamente. Los genes reloj de los tejidos pueden ser controlados  directamente  por el complejo CLOCK/BMAL1, o indirectamente a través de la expresión circadiana de factores de transcripción. De esta manera, el reloj circadiano confiere un aspecto rítmico  a un amplio rango de tejidos. En la mama, por ejemplo, la expresión  de casi 600 genes  es controlada de manera circadiana. La regulación circadiana  de la expresión de genes impacta muchos procesos celulares y conductas complejas.  Esto es ejemplificado por las proteínas SIRT1 y TIMELESS  que intersectan independientemente el reloj y el ciclo celular. Por ejemplo, SIRT1 reduce la proliferación  desacetilando β-catenina y uniéndose a p53, mientras TIMELESS avanza el reloj circadiano en respuesta al daño del ADN. Entonces, el sistema circadiano está integrado con otras fisiologías. Por lo tanto,  si ocurre la disrupción del reloj puede presentarse la enfermedad. 

La evidencia acumulada sugiere que los genes reloj circadianos juegan un rol en la biología de la mama. En ratones, las mutaciones de genes circadianos específicos provocan disrupción de los ritmos moleculares y conductuales.  Estas mutaciones también revelan el compromiso de los relojes celulares en el inicio de la carcinogénesis. El tejido mamario contiene una red de conductos ramificados rodeados por una membrana basal y una matriz extracelular estromal rica en fibroblastos y tejido adiposo. Hay variaciones rítmicas diarias en la expresión  de las proteínas reloj BMAL1 y PER2. Más aún, durante el desarrollo  de la glándula mamaria, los tejidos aislados en la misma hora del día  revelan que los niveles de ARNm de Bmal1 y Per1 aumentan  en el embarazo tardío y la lactancia, mientras disminuyen los niveles de Per2. La expresión de los genes reloj también  es controlada por el microambiente del tejido mamario. Por ejemplo, una matriz extracelular rígida como la que se observa en el envejecimiento  y el cáncer provoca la supresión  de los ritmos reloj. La rigidez local  del estroma mamario y la matriz extracelular adyacente al epitelio mamario tiene un rol mayor en el desenlace del cáncer. Los mecanismos que relacionan al exterior celular con el control reloj  aun no son conocidos, pero podrían involucrar al citoesqueleto y/o proteínas de la envoltura nuclear, entre ellas una que regula la transcripción  del gen Bmal1.  El reloj molecular  también es crucial para regular la supervivencia de las stem cells. Los ratones con un complejo CLOCK/BMAL1 defectuoso tienen comprometida la capacidad de auto-renovación  de las stem cells progenitoras, lo que revela una influencia circadiana sobre la función mamaria.  Los estudios en otros tejidos han demostrado relaciones similares entre el reloj circadiano y las stem cells. En suma: los genes reloj son expresados en la mama normal. Sin embargo, sus niveles son variables y controlados  tanto por el microambiente celular y por el estadio de desarrollo del tejido.  La disrupción de la expresión de genes reloj puede incrementar el riesgo de cáncer de mama.

Los estudios en ratones con mutaciones del gen Per revelaron un rol de los genes circadianos en el ciclo celular. Un gen Per alterado contribuye a la malignidad. En humanos, hay reducida expresión de genes Per en las células de cáncer de mama en comparación con la mama normal. Las proteínas PER1 y PER2 también promueven la apoptosis. Ellas pueden suprimir el cáncer de mama in vivo a través de la inducción de apoptosis. Sin embargo, si disminuye la expresión de Per1 y per2 en tumores de mama, se reduce la acción PER como supresor de tumor. Más aún, ellas pueden suprimir indirectamente la transcripción  de c-Myc inhibiendo la transactivación mediada por E-box por BMAL1/Npas2. La pérdida de Per2 provoca disminución de la apoptosis y por lo tanto acumulación de células dañadas. Adicionalmente, los ratones con mutaciones de Per2 exhiben desregulación de c-Myc  y sus genes blanco en el ciclo celular Ciclina D1 y Gadd45.  Altos niveles de expresión de MYC promueven la proliferación celular. Asimismo, la inhibición de PER1 altera la expresión de reguladores claves del ciclo celular y la sobre expresión  de Per1 puede reducir la proliferación de líneas celulares de cáncer de mama. Las proteínas CRY también impactan la tumorigénesis  vía ciclo celular. El supresor del ciclo celular WEE-1 es expresado en fase con PER durante los tiempos del día cuando  la entrada a la fase M es suprimida. Sin embargo, los ratones deficientes en los genes Cry tienen desregulado Wee-1 y CiclinaD1, por consiguiente exhiben disrupción  de la regulación del ciclo celular. Por lo tanto, La disrupción de PER y CRY causa regulación hacia abajo  de los genes que controlan el crecimiento, lo que implica una relación entre el sistema circadiano  y la proliferación celular. Más aún, estos hallazgos indican que el reloj circadiano está involucrado en el control del ciclo celular y la apoptosis.

El reloj circadiano  también puede iniciar y propagar el cáncer  a través de sus efectos sobre el metabolismo celular. Los reguladores metabólicos SIRT1 y AMPK son “switches” celulares que alteran la conducta de la célula de acuerdo con su estado metabólico y ambas han sido relacionadas con el reloj circadiano. La SIRT1 es una desacetilasa de histonas que se activa con altos niveles celulares de NAD⁺ y se inactiva  con altos niveles de NADH. La SIRT1 desacetila p53, inhibiendo su actividad y reduciendo la apoptosis, lo cual podría tener implicaciones  en el cáncer. El nivel  celular de NAD⁺ y la actividad desacetilasa  de  SIRT1 están bajo control circadiano. Ellas pueden retroalimentar la maquinaria reloj y por consiguiente regular al reloj circadiano. Por otra parte, el estado energético de la célula  está reflejado en la relación AMP + ADP:ATP. Cuando los niveles de ATP son bajos, la AMPK es fosforilada por una kinasa. En su estado activo (desfosforilada)  la AMPK regula muchos procesos incluyendo la captación de glucosa, la biogénesis mitocondrial, la proliferación celular  y el reloj circadiano. El reloj celular regula la actividad de la AMPK, la cual a su vez induce la degradación  de los componentes  del brazo negativo  del asa reloj, fosforilando directamente a Cry1 e induciendo la degradación de Per2 mediada por CK1.  Entonces, la disrupción del reloj podría impactar directamente  las rutas de señalización SIRT1 y AMPK, cruciales en el control de la proliferación celular, la apoptosis y las rutas supresoras de tumor. Más aún, la disrupción global  de la conducta circadiana por cambios en el horario de trabajo, jet lag y envejecimiento puede afectar el esquema de alimentación de un individuo. Esto podría provocar desbalance energético  a través del ciclo circadiano y disparar actividad perjudicial  a través de estas rutas de señalización.

El riesgo de cáncer de mama también está asociado con polimorfismos de nucleótidos en Npas2, Cry2 y Clock. La hipermetilación del promotor de Clock reduce el riesgo de cáncer de mama. El polimorfismo de nucleótidos en Clock altera directamente la expresión de genes  relacionados con la progresión del ciclo celular, como CCL5. Similarmente, los polimorfismos  en Npas2 están asociados  con mayor riesgo  de cáncer de mama. El polimorfismo Ala304Thr altera la estructura de la proteína NPAS2, lo cual interfiere   con la heterodimerización NPAS2/BMAL1. Las mujeres con este polimorfismo tienen un significativo mayor riesgo  de desarrollar la enfermedad.

La expresión del gen per se correlaciona con otros genes implicados en el cáncer de mama, por ejemplo los genes que codifican  al receptor de estrógeno (ER). El ER interactúa con PER2 y BMAL1 y es clave para la formación de los acinos mamarios, los cuales son las estructuras celulares centrales  en la mama normal. Las células epiteliales mamarias  son altamente polarizadas  y las proteínas son expresadas diferencialmente  en las células. La polaridad de las células  y la estabilidad de los acinos son vitales para dirigir la secreción de leche en la luz alveolar. Sin embargo, las alteraciones en PER2, BMAL1 o ER previenen la formación de acinos, posiblemente  a través de un asa de retroalimentación  entre los estrógenos y el reloj. La proteína PER1 también influye en la regulación transcripcional  de ER, mientras la PER2 interactúa con el ER para suprimir la transcripción de los genes blanco del ER mediada por estrógenos.   Debido a que el gen Per  también es inducido por estrógenos, hay un asa de retroalimentación que acopla al reloj circadiano  con la  ruta de los estrógenos. La ausencia de expresión de ER está asociada  con un fenotipo de tumor agresivo y la desregulación  de la actividad transcripcional  de ER puede provocar  cáncer de mama. La proteína PER también puede actuar con la proteína de cáncer de mama, BRCA1 para regular la transcripción de ER.

Los tumores de bajo grado y sin metástasis mantienen relojes circadianos funcionales. En los carcinomas más agresivos, sin embargo, las oscilaciones coordinadas  de los genes reloj  están comprometidas. Por ejemplo, en la mama, las proteínas PER y CRY están asociadas  con un mejor pronóstico en tumores ER⁺/HER2^- y las proteínas CLOCK y NPAS2 están relacionadas con un mejor pronóstico en los tumores ER^-/HER2^- más agresivos. Más aún, la alta expresión de los genes Clock, Per y Cry está asociada  con una mayor supervivencia libre de metástasis.  Por el contrario,  la pérdida de expresión del gen Per3en tumores ER^- provoca un alto grado de probabilidad de recurrencia. Asimismo, la pérdida de la co-expresión de PER3 y CRY está asociada con un mayor riesgo  de metástasis de cáncer de mama.  Mientras los niveles alterados de proteínas reloj pueden afectar la estructura tisular y contribuir  a la transformación celular, ellas también influyen en la transición epitelio-mesenquima y por lo tanto facilitan la invasión  y metástasis. Por ejemplo, la pérdida de PER2 podría manejar directamente la transición epitelio-mesenquima a través de OCT1. En condiciones normales, PER2 recluta co-represores transcripcionales  de los genes de la transición epitelio-mesenquima  Twist1, Slug y Snail. Sin embargo, PER2 es desregulado en condiciones similares a tumores, lo que permite la activación de la expresión de genes de la transición epitelio-mesenquima.

La evidencia epidemiológica de los últimos 20 años ha corroborado una relación entre relojes alterados  y cáncer de mama.  Mujeres con turnos irregulares de trabajo (una mezcla de noches y días durante la semana) tienen una  mayor frecuencia de cáncer de mama relacionado con hormonas y los casos de cáncer pueden ser mayores en mujeres que iniciaron los turnos nocturnos antes de su primer embarazo. En estas mujeres, el reloj circadiano  tiene poco tiempo para entrar al nuevo turno antes de cambiar nuevamente. Sin embargo, quienes consistentemente trabajan  de noche tienen menos disrupción en el ritmo circadiano. El elevado riesgo  de cáncer de mama también  ocurre en mujeres expuestas a altos niveles de luz ambiental en la noche. La exposición constante a la luz durante la noche altera la actividad  circadiana  del marcapaso en el NSQ. Esto a su vez provoca la disrupción de los ritmos circadianos del cuerpo. Un mecanismo puede ser a través de una alteración de la producción de la hormona  melatonina. La exposición a la luz durante la noche reduce la secreción rítmica de melatonina por la glándula pineal. Esta hormona tiene actividad oncostática en animales de experimentación con tumores mamarios  y también en cultivos de células de mama humana.  La melatonina promueve la estabilidad genómica y también tiene actividad anti-invasiva y anti-metástasis.  Por ejemplo, en canceres de respuesta endocrina, la melatonina reduce la expresión y actividad de la aromatasa, la cual normalmente convierte testosterona  en estrógeno. La acción oncostática de la melatonina sobre tumores mamarios dependientes de hormona se basa principalmente en sus acciones anti-estrogénicas, tanto reduciendo la biosíntesis de estrógenos a partir de andrógenos como neutralizando los efectos celulares de los estrógenos. Ratas  expuestas a pequeñas cantidades de luz en la noche, tienen disrupción del perfil de melatonina  y tumores mamarios de crecimiento rápido que pueden ser revertidos  con suplementación de melatonina. En humanos, la reducción de los niveles  nocturnos de melatonina puede incrementar los efectos de los estrógenos y contribuir a un mayor riesgo de cáncer de mama. Otro potencial mecanismo que relaciona la exposición a la luz durante la noche  con el cáncer de mama es la regulación circadiana  de la expresión de micro-ARN (miARN). Varios miARN  involucrados en el riesgo de cáncer de mama muestran fluctuaciones durante el día. Por ejemplo, los niveles de MiR-150-5p y miR-133a-3p son dramáticamente alterados por la disrupción circadiana. Algunos de estos miARN están interconectados con la expresión  de proteínas que tienen roles conocidos en el cáncer de mama como NFκB y Stat3. La pérdida de la conducta rítmica por lesiones en el NSQ también puede incrementar el riesgo de formación de tumor y aumentar la progresión de tumores pre-existentes. Estos hallazgos sugieren  que la disrupción de los relojes circadianos por la exposición a la luz en la noche tiene un rol  adverso sobre la progresión del tumor. Esto aplica para aquellas mujeres con turnos de trabajo irregulares, aunque es aun tema de controversia si los episodios repetidos de jet lag o el extenso uso de luz eléctrica en la noche contribuyen al cáncer de mama.

En conclusión, los relojes circadianos de la mama son coordinados por el NSQ y son influenciados por factores fóticos, endocrinos, neurales y metabólicos.  En la mama, los relojes circadianos regulan la expresión rítmica  de numerosos genes. La disrupción de la expresión  de los genes circadianos  puede alterar la biología de la mama  y promover el cáncer. Los estudios en ratones han demostrado la importancia  de los genes reloj  en la renovación  de células progenitoras, la incidencia de tumores o la interacción con la ruta de los estrógenos. Esto indica que hay un rol oncostático  de algunos genes reloj. Los defectos en los genes reloj del epitelio mamario  pueden provocar disrupción del ciclo celular. Esta disrupción causa una división celular alterada, incremento de la susceptibilidad al cáncer de mama y tumores más agresivos. Los datos epidemiológicos relacionan un incremento en la incidencia  de cáncer de mama  en mujeres con turnos irregulares de trabajo. El estilo de vida nocturno perturba los patrones normales de la conducta circadiana, lo cual resulta en efectos perjudiciales sobre rutas fisiológicas y metabólicas controladas por relojes circadianos.  A la luz de estos datos, se ha propuesto que el cáncer de mama no debería ser visto como un desorden local  sino como resultado  de defectos sistémicos en el control tisular.

Fuente: Blakeman V et al (2016). Circadian clocks and breast cancer. Breast Cancer Research 18: 89.