Modulación de la regulación epigenética por ARN no codificantes

La epigenética es conocida  como la regulación de la expresión de genes sin cambios en su secuencia ADN. El  desarrollo reciente de la biología molecular ha incorporado un  nivel de mayor complejidad a los mecanismos epigenéticos clásicos como la metilación de ADN o las modificaciones post-translacionales  de histonas. En este nuevo enfoque, la expresión de genes  puede variar debido a la función de las moléculas  de ARN por sí mismas  o por sus interacciones  con ADN y/o proteínas.  Específicamente, el énfasis apunta hacia la capacidad  de los transcriptos ARN no codificantes (ARNnc) para modular la expresión de genes, es decir, su rol como modificadores epigenéticos. Los patrones de metilación de ADN, una marca epigenética clásica ligada a la expresión de genes, han sido  demostrados en plantas y mamíferos como establemente transmitidos a la descendencia. Sin embargo, el estatus de metilación de ADN no es transmitido  con perfecta fidelidad, provocando diferencias entre los clones de poblaciones celulares.  Asimismo, las modificaciones de las proteínas histonas, mecanismos epigéneticos tradicionales, son dinámicamente editadas por desmetilasas y su distribución puede cambiar en pocas horas en respuesta a estímulos ambientales. Sobre la base de estos datos,  los investigadores han propuesto una expansión  de la definición de epigénetica que incluya las alteraciones  en la cromatina que reflejen ambientes celulares dinámicos y estados de actividad, y la regulación por ARNnc es parte de este cuadro.  Es conocido que durante la fertilización y la implantación del embrión ocurre la desmetilación de ADN  así como su posterior re-metilación,  y que la ADN metiltransferasa 1-3 propaga la metilación CpG después de la fase S a través de las mitosis por asociación  con ADN hemimetilado. La transmisión de las modificaciones de histonas podria involucrar proteínas Polycomb  y seguir un modelo “semi conservador” (similar a la replicación  de ADN) o un patrón aleatorio. En cualquier caso, se requiere de una molécula que reconozca y lleve la metilación paterna a las histonas nuevas.  Las especies ARNnc  están involucradas en la regulación expresión degenes  a través de su influencia  sobre los mecanismos anteriores. Por lo tanto, el rol de los ARNnc en la epigenética parece consistir en reclutar y guiar estos procesos en el momento apropiado  del ciclo celular  a través de la vida deun organismo.

La gran mayoría del genoma humano  es transcripta pero solamente 2%  de estos transcriptos terminan en proteínas. Muchos de los transcriptos restantes  no codifican para proteínas  y fueron registrados inicialmente como artefactos experimentales o “junk”, pero la evidencia demuestra que estas moléculas de ARN pueden ser funcionales.  Más aún, el significado de esta transcripción en la biología de los mamíferos es apoyada por la fuerte correlación entre complejidad del organismo y tamaño del genoma no-codificante mas que por la relación proteína-genoma codificante. Generalmente, los ARNnc de menos de 200 nucleótidos  de longitud son clasificados como cortos y todos los transcriptos más grandes son  registrados como ARNnc largos (lARNnc). Hay varios subtipos entre las especies de ARNnc largos y cortos, muchos de los cuales están involucrados en la regulación de la expresión de genes y pueden ser agrupados de acuerdo con el origen genómico y los procesos biogénicos.

Los lARNn son altamente diversos en estructura y función, por lo que la longitud de la secuencia y la carencia de capacidad codificante quizá sean sus únicas características definitorias. No obstante, han surgido varios patrones que son de interés en el contexto de la regulación epigenómica. Una consideración importante es que mientras la conservación de la secuencia  de loslARNnc es pobre, los transcriptos con posiciones y direcciones correspondientes en referencia a los genes que codifican proteínas son más comunes, lo que indica que sus funciones pueden ser bien conservadas. Frecuentemente, los lARNnc son procesados de manera similar  a los ARNm  y se pueden encontrar en fracciones nucleares o citoplasmáticas. A menudo, los lARNnc son transcriptos  a partir de loci codificantes de proteínas, pero también se han descrito varias subclases de lARNnc con orígenes diferentes. Algunos lARNnc pertenecen a intrones y están compuestos de elementos genómicos transportables. Por otra parte, aunque la existencia de los lARNnc es conocida desde hace varias décadas, la descripción de ARNnc largos intergénicos (liARNnc) es relativamente reciente. Algunas veces,  ambos términos son intercambiables en la literatura, pero rigurosamente el término “liARNnc” se refiere  solamente al subgrupo de lARNnc  que proviene de regiones intergénicas.  Los roles funcionales de los lARNnc pueden agruparse en uno o varios patrones. Por ejemplo, algunos transcriptos son producidos en reacción a perturbaciones en el ambiente celular mientras otros sirven como intermediarios, facilitando el bloqueo de procesos conocidos (incluyendo mecanismos epigenéticos) que involucran ácidos nucleicos y/o proteínas.

Los ARNnc cortos, a diferencia de los lARNnc, se clasifican en base a su origen genómico y a su mecanismo de acción. Muchos de estos subgrupos tienen consecuencias importantes para la expresión de genes, afectando la transcripción y otros procesos. Los microARN (miARN) mejor estudiados son de 20-30 nucleótidos de longitudy usualmentereconocen ARNmpor complementariedad en regiones de 2-7 nucleótidos de la 3`UTR pero también puede ocurrir en la 5`UTR. Esta unión  activa al complejo silente inducido por miARN a través del cual los miARN actúan como represores post-transcripcionales  de la expresión de genes. Este proceso incluye a la endoribonucleasaDicer, la cual está involucrada en la formación de otra clase emergente de ARNnc cortos, los siARN endógenos (endo-siARN). Estos transcriptos  no han sido muy estudiados, pero  se ha visto que a diferencia de los miARN requieren secuencias extensas de complementariedad para inducir la represión de genes. Para producir estos pequeños endo-siARN, la Dicer actúa sobre ARNnc formados  a partir de pares de transcriptos naturales en un locus simple o a partir de pares gen-pseudogen, lo cual puede incluir  transcriptos de distintos cromosomas o a partir de asas que contienen secuencias repetidas.Los ARN que interactúan con PIWI (piARN), otra categoría de ARNnc cortos endógenos, de 26-30 nucleótidos, son independientes  de la Dicer. Los transcriptos precursores de piARN son  clivadosendonucleoliticamenteen el citoplasma. Los piARN pueden silenciar la transcripción  de ARN  a través de apareamiento de bases que conducen a la trimetilación de histona3lisina9 (H3k9mc3, un marcador de cromatina inactiva) por la histona metiltransferasa.

El grupo Polycomb de proteínas fue identificado en D. melanogater por su capacidad  de causar genes silentes heredables. Los complejos Polycomb ocurren en diferentes especies y están compuestos  por subunidades análogas con roles especializados; incluyendo proteínas con dominios de unión a ARN o dominios catalíticos con actividad modificadora de histonas.  Otras subunidades incluyendo los cromodominios  de las proteínas complejo Polycomb represivo 1 (PCR1) se unen a histonas modificadas como la trimetilada histona 3 lisina 27 (H3K27me3). Un ejemplo bien estudiado  de un ARNnc involucrado en el silenciamiento de genes  a través del reclutamiento Policomb es el que tiene lugar  durante la inactivación del cromosoma X, lo cual asegura dosis iguales  de genes ligados a cromosoma X en mamíferos femeninos. El XIST, un lARNnc de 17kb es esencial para este proceso, un ARN del XIST recluta al complejo Polycomb represivo 2 (PCR2) provocando la trimetilción H3K27 en la inactivación del cromosoma X. El PCR1también es reclutado para la inactivación del cromosoma X.

La mayoría de lARNnc que interactúan con complejos Polycomb son ejemplos de transcriptos que operan en cis, es decir que actúan en la misma región en la cual ellos son transcriptos. Otros lARNnc trabajan en trans, utilizan proteínas PcG para modificar la expresión de loci distantes.  Por ejemplo, el HOTAIR, un lARNnctrans activo de 2,2kb transcripto a partir del cromosoma 12, reprime genes en el cromosoma 2 de humanos reclutando los complejos  PRC2 y LSD1, lo cual causa  la trimetilación H3K27 y la pérdida de la activadora H3K4me3. Recientemente, la sobre-expresión de un  ARN trans activo llamado UBC1 fue reportado en muestras de cáncer de vejiga. Este transcripto asociado con al menos dos subunidades PRC2 –EZH2 y SUZ12- está involucrado en la represión  de varios blancos conocidos de ese complejo. La asociación de PCR2 con cromatina activa también ha sido reportada. Específicamente, la subunidad EZH1 del PCR2 de mamíferos puede unirse a dominios activos  y promover la elongación transcripcional durante el desarrollo de los miocitos.

Los lARNnc , además de la interacción con proteínas PcG, también regulan la expresión de genes a través de interacciones  con otras enzimas epigenéticas. En efecto, Fendrr, un lARNnc involucrado  el desarrollo cardiaco, regula genes individuales  específicamente a través de la unión y/o modulación  al promotor de PRC2 y H3K4 metiltransferasa. En contraste con los lARNnc que funcionan exclusivamente  a través de mecanismos PRC2, otros transcriptos actúan incrementando la expresión  de genes. Los lARNnc también han sido implicados  en el silenciamiento de genes  a través de la metilación  del ADN. La dinámica de las modificaciones  de histonas y ADN sugiere un mecanismo para su remoción. Mientras la desacetilación de histonas y la desfosforilación  y desmetilación de ADN han sido reconocidos desde hace algún tiempo, la idea de desmetilación de histonas había sido controversial  hasta el descubrimiento de la amino oxidasa nuclear LSD1. Esta enzima cuando es anclada al gen por el lARNnc HOTAIR causa la represión del gen a través de la remoción de H3K4me3.  Sin embargo, otras especies de desmetilasas potencialmente pueden activar la expresión a través de  histonas metiladas.

Los ARNnc cortos tienen muchas interacciones con las rutas epigenéticas tradicionales  y la modulación de estos transcriptos puede tener importantes consecuencias. Los ARNnc cortos controlan la expresión de genes principalmente afectando la transcripción o la estabilidad delARNm. Adicionalmente, estos ARN cortos interactúan  con el PRC2 estabilizando el complejo cerca del sitio de transcripción,  provocando la represión de la cromatina en cis.  Más aún, los miARN son conocidos reguladores de la expresión de varios componentes  delos complejosPolycomb. Al menos dos miARN que son regulados negativamente por oncogenes involucrados en la tumorigénesis, incrementan la expresión de la histona metiltransferasa EZH2. Otros miARN actúan  como supresores tumorales  a través de la inhibición de la “stemcell” Bmil, la cual es también componente del PRC1.  En cambio, el miARN-214 reduce la expresión de EZH2 y promueve la diferenciación de músculo esquelético. La ruta ARNi es crucial para la formación  de heterocromatina y su propagación a través de las divisiones celulares. Esto sugiere un mecanismo para los cambios en la expresión de genes inducidos por endo-siARN.

Las histonas desacetilasas (HDAC), como proteínas PcG, están involucradas en el silenciamiento de genes   a través de la remoción  de marcas activadoras más que por la deposición de modificaciones represivas. Algunas HDAC han sido implicadas en enfermedades, la sobre-expresión de HDAC1, por ejemplo,  ha sido observada en ciertos tipos de cánceres. Sin embargo, en el carcinoma hepatocelular, la sobre-expresión de HDAC1-3 ha sido asociada con disminución dela proliferación y formación  del tumor.

Los miARN regulan negativamente la metilación de ADN, lo cual frecuentemente resulta en un incremento de la expresión de genes. Por ejemplo, en células de cáncer de pulmón y leucemia, la expresión de miARN disminuye la tumorigenicidadin vitro e in vivo. Los endo-siARN también pueden estar involucrados en la metilación de ADN. En este caso, el proceso ocurre en dos etapas, el reclutamiento inicial de siARN y luego la metilación de ADN cis o trans.

Además de influir en la expresión y función de enzimas epigenéticas, muchos ARNnc son blancos de estos mismos procesos. Esto, a diferencia de otros genes regulados epigenéticamente, a menudo tiene el efecto de regular negativamente cambios en la expresión degenes. Este concepto está bien ilustrado  en la biología normal y en las perturbaciones que ocurren en las enfermedades. Por ejemplo, la hipermetilación y la disminución  de la expresión  de un grupo de miARN están asociadas con cáncer de mama en humanos. También, varios miARN (incluyendo al miARN128a) son más altamente expresados en el cerebelo de adultos que en el de niños y son regulados negativamente en el meduloblastoma, un tumor del cerebelo. El miARN128a inhibe al Mmi-1, un miembro del complejo PRC1, y promueve la disminución  de la proliferación de células de meduloblastoma. Entonces, el programa de desarrollo normal involucra la expresión dinámica de este miARN, mientras que la reversión a un estado de desarrollo temprano está asociada con cáncer. La perdida de represión post-transcripcional de un miARN resulta en un incremento de la acción del complejo PRC1, causando cambios en el estado de la cromatina. Los miARN no son los únicos ARN cortos involucrados en la patogenia de las enfermedades a través de rutas epigenéticas, los endo-siARN también pueden causar cambios en la expresión de genes  ambientalmente sensibles en los tejidos somáticos.

En conclusión, la regulación epigenética de la expresión de genes es un concepto que explica la contribución del ambiente en la biología de un organismo. Sin embargo, la definición contemporánea de epigenéticatambién incluye al silenciamiento de genes o la regulación positiva causadas por ARNnc, lo cual ocurre en la biología normal bajo la influencia de complejos epigenéticos. Esta amplia definición incorpora las influencias ambientales causantes de enfermedades que pasan a través de divisiones celulares, como se ha visto en el cáncer. También cubre las discrepancias críticas en la expresión de genes observadas entre células con secuencias idénticas de ADN, durante la diferenciación, o entre tejidos en desarrollo. La regulación  dinámica, ambientalmente sensible, de la expresión de genes por ARNnc largos y cortos ocurre a través  de la interacción directa e indirecta  con los mecanismos epigéneticos clásicos, formando una extensa red epigenética.  Los ARNnc son conocidos por su capacidad de  unirse a -y reclutar- complejos que modifican histonas  o por remover grupos metilos y acetilos. Estos transcriptos también modulan ADN metiltransferasas, facilitando o suprimiendo la metilación del ADN. Los loci que son blanco  de cada uno de estos mecanismos pueden codificar proteínas y codificar o no codificar  transcriptos ARN. Los ARNnc a su vez pueden afectar la expresión de genes interactuando  con ARNm o a través de mecanismos de retroalimentación.  Estos hallazgos pueden contribuir  a la versión modificada  del “dogma central”  de Francis Crick en el cual el ARN no sólo es una parada en la ruta entre ADN y proteína, sino que también proporciona importante retroalimentación reguladora para la transcripción y la translación. Por lo tanto, además del rol de los ARNnc en la epigenética clásica, estos transcriptos pueden servir como intermediarios epigenéticos transmitiendo el mensaje  a través de una amplia red de regulación dinámica de la expresión de genes.

Fuente: Peschansky VJ y Wahlestedt C (2014). Non-coding RNAs as direct and indirect modulators of epigenetic regulation. Epigenetics 9(1): 3-12.